技術領域

本發明涉及細胞系，尤其是涉及一種大黃魚頭腎細胞系及其構建方法。

背景技術

目前，世界上已建立的細胞株和細胞系至少有數千種，包括人和動物的正常細胞、腫瘤細胞以及遺傳缺陷型細胞等，其中，海洋生物的細胞培養晚于陸生生物。魚類養殖業的迅猛發展也促進了魚類細胞系的建立及其在病毒檢測、疫苗和病理毒理方面的應用。魚類細胞系建立始于20世紀60年代。1962年，Wolf等(WOLF?K，QUIMBY?M.Established?eurythermic?line?of?fish?cells?in?vitro.Science1962.135:1065-1066.)首次建立了虹鱒生殖腺細胞系RTG-2，該細胞系在實驗室傳代培養至今。此后，魚類細胞系培養發展迅速，至2010年,全世界已報道建立的魚類細胞系約有275類,其中大多數來自淡水魚或溯河產卵的海洋魚類。淡水魚類和溯河洄游性魚類來源的細胞系約175株,分別來源于71個科的89種魚類的不同組織;而海水魚類及咸水魚類的細胞系僅有約100株,分別來源于23個科的35種海水魚類的不同組織（張博，陳松林.近10年魚類細胞培養研究進展及應用展望.Marine?Sciences2011.35:113.）。

大黃魚Pseudosciaena?crocea（Richardson）俗稱黃花魚，屬鱸形目石首魚科黃魚屬，是我國特有的地方性種群，分布范圍北起黃海南部，經東海、臺灣海峽，南至南海雷州半島以東。其肉質鮮嫩，是我國人民喜食的海產魚，除供鮮食外還可加工制成風味和特色的水產品。此外，大黃魚具有藥用價值，其耳石具清熱作用，鰾有潤肺健脾、補氣活血之功能。近年來，隨著環境污染日益加劇和養殖業過度膨脹，大黃魚病害問題日趨嚴重，各種傳染性疾病頻頻暴發，造成大黃魚死亡率逐年上升，經濟損失嚴重，極大地影響了大黃魚養殖業的健康發展。本發明利用大黃魚重要免疫器官-頭腎建立了能夠在體外連續培養的細胞系，該細胞系目前在體外傳至第70代以上，可用于大黃魚免疫學及相關的細胞生物學、分子生物學研究。

發明內容

本發明的目的在于利用大黃魚免疫組織—頭腎，提供一種大黃魚頭腎細胞系及其構建方法。

本發明的另一目的在于提供一種大黃魚頭腎細胞系在分子免疫學、功能基因研究中的應用。

所述大黃魚頭腎細胞系為大黃魚頭腎細胞系LYCK，已于2013年8月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：C2013113，保藏中心地址為湖北省武漢市武漢大學。

所述大黃魚頭腎細胞系的構建方法，包括以下步驟：

1）配制細胞培養基；

2）原代培養的建立；

3）傳代培養。

在步驟1）中，所述配制細胞培養基的方法可為：取GIBCO公司的L-15培養基粉末，溶解后，抽濾，分裝，取少量做無菌測試，4℃保存，得基礎培養基；臨用前加入10%～20%的胎牛血清，雙抗，于4℃保存，得完全培養基。

在步驟2）中，所述原代培養的建立方法可為：取3尾健康大黃魚，量體長，稱重，浸入75%的乙醇中，進行體表消毒和麻醉，立即解剖；在事先備好的玻璃瓶中加入2mL含有2×雙抗（青霉素200U/mL，鏈霉素0.2mg/mL）的L-15基礎培養基，先剪斷大黃魚脊椎，依次分離大黃魚的頭腎組織，放入步驟1）所得到的基礎培養基中清洗，至少漂洗3次，洗好后，在含上述基礎培養基的玻璃瓶內將頭腎組織剪成碎塊，糜狀最好；去除基礎培養基，加入2mL胰酶消化15～20min，再加入含20%FBS和2×雙抗的L-15完全培養基終止消化反應；用無菌尼龍濾網過濾上述消化產物；1000～1500rpm離心10min，棄上清；加入L-15完全培養基重懸細胞沉淀，1000rpm再次離心10min，棄上清；加入完全培養基重懸細胞沉淀，并轉至25cm²細胞培養瓶中，補加完全培養基至5mL，28℃細胞培養箱中靜置培養。

在步驟3）中，所述傳代培養的方法可為：細胞長成單層后，吸出培養基，加入PBS漂洗細胞，加入含有0.25%EDTA的胰蛋白酶進行消化，顯微鏡觀察下待細胞變圓即吸棄胰酶，加入新鮮培養基制備細胞懸液，一分為二接種至兩個培養瓶中，于28℃培養箱中培養。

本發明具有以下突出優點：

1、本發明建立的大黃魚頭腎細胞系形態為纖維狀，該細胞系可以連續傳代，大黃魚頭腎細胞系已傳70代以上；能大量提供大黃魚的頭腎細胞系；該細胞系可以直接應用于各種大黃魚免疫相關功能基因研究。