技術領域

本發明屬醫藥領域，涉及TALEN技術在靶向乙肝病毒基因組及治療慢性乙肝病毒感染中的應用。

背景技術

乙肝病毒（HBV）是一種肝嗜性小DNA病毒，其引起的慢性肝炎、肝纖維化和肝癌嚴重危害著人類的健康。全球約3.5億人慢性感染有乙肝，其中亞洲占約3/4。

乙肝病毒病毒核衣殼內的乙肝病毒基因組是含有不完全雙鏈的DNA（rcDNA），在病毒感染人肝細胞后，隨著核衣殼脫去，rcDNA會入核并經由修補機制形成共價閉合環狀的DNA（cccDNA）。cccDNA可經由宿主RNA聚合酶II轉錄出包括乙肝病毒病毒前基因組RNA（pgRNA）在內的多條長短不一的乙肝病毒RNA，病毒蛋白即以此些RNA作為模板進行翻譯，其中pgRNA還可以作為模板通過逆轉錄生成rcDNA，進而包裝入病毒核衣殼蛋白而進入新的一輪復制周期。此外，研究表明cccDNA可以結合宿主組蛋白以形成微小染色體結構，該結構非常穩定以致cccDNA的最終消失可能要伴隨其所在肝細胞的死亡。正是由于cccDNA在乙肝病毒復制過程中作為DNA-RNA-DNA模板以及cccDNA很難徹底于肝內清除的特性，cccDNA在乙肝病毒感染慢性化、再發及治療停止耐藥中扮演重要角色。

當前用于治療慢性乙肝病毒感染的藥物有干擾素α（IFN-α）或阻斷病毒RNA或DNA合成的核苷類似物，但是IFN-α治療應答率僅30%而核苷類似物的長期使用易導致乙肝病毒耐藥，同時這兩種藥物但都不直接靶向cccDNA，這也是目前的治療手段應用于許多慢性乙肝病毒感染患者中效果不佳且易引起復發的原因之一。發明一種特異性靶向cccDNA的治療方法對于乙肝病毒治療乃至根治乙肝病毒慢性感染有重要意義。

發明內容

本發明的一個目的是提供轉錄激活因子樣效應因子（Transcriptionactivator-likeeffectors，TALE）核酸酶在制備靶向干預乙肝病毒的藥物中的應用。

本發明的另一個目的是提供一種針對乙肝病毒的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶。

本發明的再一個目的是提供一種利用轉錄激活因子樣效應因子核酸酶抑制體外培養細胞中乙肝病毒的方法。

為了解決上述技術問題，本發明首先設計了兩對針對乙肝病毒基因組的特異性TALEN，在設計過程除考慮TALEN識別長度（12-19bp）及左右臂間隔長度（14-19bp）外還額外考慮了以下兩點以保證TALEN對乙肝病毒的有效性：

1、根據NCBI公布的已有乙肝病毒A型、B型、C型序列（其中我國主要是B型和C型），下載并比對了各型別代表株的序列，確定了各型別乙肝病毒基因組的保守序列區段，進而針對這些區段設計TALEN，以利于設計出的TALEN可以廣譜靶向各型別的乙肝病毒。

2、設計TLANE時避開了根據文獻報道可能結合有宿主組蛋白的cccDNA區段，以利于TALEN結合至cccDNA。

本發明最終設計并構建完成的TALEN分別針對在cccDNA序列中轉錄pgRNA相關的片段的頭尾，其中頭部設計在與Core、Pol、HBeAg和pgRNA轉錄密切相關的區段；尾部設計在HBx啟動子區域，其亦為乙肝病毒其他各條病毒RNA轉錄所共有的區域。

利用細胞和小鼠模型,經過無數次試驗摸索以及反復優化條件，本發明最終獲得了一種TALEN,其不僅可以抑制乙肝病毒抗原標志物HBsAg和HBeAg的產生，并且可以部分降低cccDNA的含量及可以使cccDNA特定位點發生突變進而導致轉錄失活；此外，在合適時間加入IFN-α（α干擾素）等乙肝治療藥物可以進一步降低pgRNA轉錄水平和cccDNA的含量，顯示聯用TALEN和其他抗病毒及免疫調節藥物在治療乃至根治乙肝病毒感染中的可能性。

本發明提供了一種轉錄激活因子樣效應因子核酸酶在制備抑制乙肝病毒藥物中的應用。

所述的抑制乙肝病毒藥物的活性成分是針對乙肝病毒的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶。

本發明提供了一種抑制體外培養細胞中乙肝病毒的方法，將針對乙肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶轉入含有乙肝病毒的體外培養細胞。

所述的體外培養細胞源自肝細胞。

所述的體外培養細胞是肝癌細胞。

所述的抑制體外培養細胞中乙肝病毒是指抑制乙肝病毒的病毒蛋白轉錄和cccDNA活性。

本發明提供的種抑制體外培養細胞中乙肝病毒的方法，包括如下步驟：

（1）設計并預處理針對乙肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶；