技術領域

本發明涉及一種檢測生物大分子的方法，尤其涉及一種基于間接信號分析模式的磁分離-量子點免疫熒光傳感檢測方法及相關試劑制備與使用方法。?

背景技術

傳染性的動植物致病菌和病毒是出入境檢驗檢疫工作中重點監控對象，對這些具有傳染性的有害生物進行快速、準確、便捷的檢測，對保護人類健康及生命安全、保障國門安全、維護社會穩定具有重要的意義。?

目前檢測該致病菌和病毒的檢測方法主要包括分離培養檢測、免疫學檢測、分子生物學等方法。分離培養方法簡單、易行，但由于其檢測靈敏度低、耗時長，無法達到檢疫要求。免疫分析法具有簡單、快速、成本低等優點，適合于大規模樣品篩查，但其靈敏度比較低，因此其使用也受到一定的限制。分子生物學方法檢測靈敏度較高，特異性較好，但需要昂貴的儀器和較高的專業技術，因此其應用受到一定限制。因此，口岸檢驗檢疫急需建立一種快速、靈敏檢測致病菌和病毒的方法。?

基于超順納米磁珠的免疫磁性分離技術具有免疫反應的高度特異性和磁性分離的快速、簡單和高效的優點，是目前應用最廣泛的磁分離技術，近幾年已被廣泛地應用于腫瘤細胞分離、富集、目標蛋白質和多肽的富集、臨床診斷、食品安全快速檢測、環境監測等領域方面的研究中。在免疫磁富集反應中，免疫磁珠和目標物的識別是在懸浮溶液中進行的，是一種均相的免疫反應形式，因此可以和其他很多技術結合起來，構建一系列新型的分析方法，例如磁分離-熒光免疫分析方法，磁分離-化學發光分析方法，磁富集-微流控芯片技術，磁分離-表面等離子共振生物傳感器，磁富集-石英晶微天平生物傳感器等方法。由于免疫磁分離技術的發展，大大促進了相關分析技術的發展，其應用潛力正在不斷地發掘出來。?

量子點作為一種新型的熒光/磷光探針在熒光成像、食品和環境中農獸藥殘留、相關致病菌和病毒的檢測，生物芯片多靶標檢測等領域得到了廣泛地應用，其具有許多優越的光學性質：熒光強度穩定，抗光漂白性強；具有一元激發，多元發射的優勢，是一種理想的多元標記材料；激發譜帶寬、發射譜對稱而狹窄，且發射波長與其粒徑相關，能有效克服有機熒光探針發射光譜較寬和易與受體的發射光譜重疊的弱點，適合多元檢測。?

目前，已經有很多研究者將量子點優異的熒光性能和免疫磁性分離技術的優勢結合起來，構建了磁分離-熒光免疫傳感器，該傳感器和傳統的ELISA相比，具有樣品前處理少，分析速度快、靈敏度高，可以實現高通量、多靶標檢測，已經在食品和環境安全、檢驗檢疫等領域得到了廣泛地應用。但傳統的磁分離-量子點傳感器存在需要解決的問題，傳統的磁分離-量子點免疫傳感器的熒光信號來自免疫磁珠通過抗原-抗體特異性反應結合上的量子點免疫探針，這種分析模式有兩個缺點：第一，免疫磁珠本身有熒光，會造成熒光背景干擾；第二，量子點的直徑比免疫磁珠小一個數量級，當激光照射過來以后，磁珠另外一表面的量子點的熒光無法被有效地激發，這種現象就如同“白天和黑夜”的現象，因此造成有效的熒光信號損失。針對第一種來自超順磁珠的背景熒光干擾問題，有研究者通過調節量子點的熒光發射峰的位置，避開免疫磁珠本身的熒光峰位置，基本上可以克服熒光背景值的問題。但對于第二個問題的解決辦法，目前還沒有相關的報道。為了克服上述的缺點，擴展該熒光傳感器的應用范圍，本章擬采用一種新型的間接信號分析模式，當加入的量子點免疫探針總量一定的條件下，檢測沒有結合在免疫磁珠上的量子點的熒光強度就可以反推出樣品中目標物的含量。?

發明內容

在本發明中，我們構建了一種普適性的，快速，靈敏的均相免疫傳感器用致病菌和病毒的檢測，該免疫傳感器基于磁分離-量子點間接熒光信號分析模式。在間接信號分析模式中，剩余的量子點免疫探針的熒光強度作為熒光信號，從而避免來自超順納米磁珠自身熒光干擾問題，采用間接信號分析模式不僅可以避免背景熒光干擾的問題，而且可以提高有效的熒光?信號值，進而提高方法的靈敏度。另外間接信號分析模式不需要重新懸溶免疫磁珠-量子點免疫復合物，從而簡化了實驗操作步驟圖1。?

基于間接信號分析模式的超靈敏QDs-MB免疫傳感器用于生物大分子的檢測步驟如下：?

1.超順納米免疫磁珠MB-Ab1(1)的制備?

1.1磷酸鹽緩沖溶液PBS的配制：磷酸氫二鈉0.2mol?L^-1和磷酸二氫鈉0.2mol?L^-1按照一定量的比例混合，配制成0.01mol?L^-1磷酸鹽緩沖溶液，pH＝7.0-7.4。?