技術領域

本申請涉及一種用于何首烏及其中藥制劑肝毒性評價的生物毒性效價檢定方法。

背景技術

何首烏是常用的傳統補益類中藥，為祖國草藥中的四大仙草之一。何首烏作為一種常見的補益類中藥，不論單用、配伍還是處方、非處方以及保健品的應用都非常的廣泛。在民間何首烏流傳為補肝腎、烏須發、乃至長生不老的仙藥，在一定程度上夸大了何首烏的功效，而其可能引發肝損傷的風險卻很少受到重視，因而近年來國內外相繼出現了何首烏肝毒性與不良反應的報道。

《中華人民共和國藥典》收載何首烏及其炮制加工品制何首烏，生首烏具有解毒、消癰、潤腸通便的功效。制何首烏性補益精血、烏須發、強筋骨、補肝腎等功效，制首烏的肝毒性較生首烏輕，但是仍然存在有一定程度的損害，臨床上的應用也主要以制首烏為主。何首烏的炮制方法較多，藥典收載何首烏的炮制方法有清蒸法、黑豆汁蒸法和黑豆汁燉法。目前市場上制何首烏的質量參差不齊，其炮制方法及炮制時間是否符合藥典規定尚未可知，這大大增加了何首烏引發肝損傷的風險。因此，何首烏的質量控制成為其臨床安全應用的重要前提。

目前何首烏質量控制方法主要是用高效液相色譜法測定二苯乙烯苷和蒽醌的含量。但由于何首烏毒性物質不明確，因此通過化學成分分析法并不能有效地表征何首烏的肝毒性。因此，需要一種能夠直觀地標示出何首烏的總毒性大小，保障臨床用藥安全性的毒性生物檢測方法。

發明內容

本申請的目的是提供一種用于評估何首烏及其中藥制劑肝毒性的生物毒性效價檢定方法。

毒性效價(toxic?potency)檢定方法是以中藥產生的毒性為基礎，融入定量藥理學與藥檢分析的雙重屬性和要求來表征中藥安全性的一種實驗方法，從而為其質量控制提供依據。在檢測何首烏及其中藥制劑肝細胞毒性時，細胞抑制率的結果主要是重現其肝細胞毒性的趨勢和規律，不一定要重現試驗數據的絕對值，重在證實試驗結果與對照組比較是否具有顯著性差異及統計學意義；而毒性效價的檢測則要求重現試驗數據的絕對值，同時還需確定線性范圍，并考察精密度、重現性、甚至回收率，因此毒性效價的檢定較單純的抑制率檢測重現性好，能夠更為準確可靠的評價何首烏及其中藥制劑的質量，保證臨床安全用藥。

具體地，本申請提供了一種用于評估何首烏及其中藥制劑肝毒性的生物毒性效價檢定方法，所述生物毒性效價檢定方法包括下述步驟：

a.配制供試品溶液和供試品稀釋液

制備何首烏或其固體制劑的干浸膏；

在測定前，用細胞培養液將所述干浸膏配置成供試品溶液，過濾除菌，備用；

測定時，估計供試品毒性效價，用所述細胞培養液稀釋供試品溶液，得到不同濃度的供試品稀釋液；

其中所述干浸膏如下制備：

稱取何首烏或其固體制劑形式的供試品粉末，用乙醇浸泡，超聲處理，過濾，得到的濾液減壓濃縮，真空干燥，制得干浸膏，計算收率；

b.配制對照品溶液和對照品稀釋液

用所述細胞培養液將具有肝細胞毒性的對照品配制成對照品溶液，過濾除菌，貯存，備用；

測定時，用所述細胞培養液稀釋對照品溶液，得到不同濃度的對照品稀釋液；

c.測定

以肝細胞作為供試細胞，將所述肝細胞接種于細胞培養板中，并在培養箱內培養12～48小時，吸出細胞培養液，加入所述對照品稀釋液或所述供試品稀釋液，放入培養箱內孵育，之后吸出培養板內的對照品稀釋液或供試品稀釋液，計算細胞抑制率；

d.生物毒性效價計算

對細胞抑制率進行數據轉換，并將轉換結果作為評價指標，按照中國藥典2010版二部附錄XIV生物檢定統計法中的量反應平行線二劑量法計算毒性效價及實驗誤差，可信限率FL％不超過40％。

其中，所述細胞培養液是在常規方法中用于培養肝細胞的細胞培養液。

其中，估計供試品毒性效價的方法可以通過檢測供試品在一個大的劑量范圍內的細胞抑制率的預實驗來進行，所述預實驗如上文的步驟c所述的方法。

在一些實施方式中，所述細胞培養液可以由1640培養液、胎牛血清和10000U/ml的青鏈霉素配置而成。

在一些實施方式中，所述細胞培養液中的1640培養液、胎牛血清和10000U/ml的青鏈霉素的體積百分數可以分別為89％、10％和1％。