技術領域

本發明屬于樹枝狀大分子合成、基因載體及生物細胞標記領域，特別涉及一類合成可生物降解的苝類熒光樹枝狀大分子應用于非病毒體系的基因載體。

背景技術

伴隨先進生物技術療法的發展，基因導入體系變得更加重要。目前常用的基因載體主要有病毒型和非病毒型兩大類，病毒型基因轉染載體具有安全問題及低基因轉染效率的局限性，限制了它們的應用范圍。研發具有安全性的非病毒基因載體一直是生物材料領域的熱點研究課題。目前研究較多的非病毒基因載體體系主要有陽離子多聚合物型載體、可生物降解的聚合物體系、多復合物脂質體體系、熱敏型聚合物體系等。研究得比較多的陽離子型基因載體有聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴氨酸（PLL）以及聚酰胺-胺型樹枝狀高分子（PAMAM），其中樹枝狀高分子的應用研究尤其受到重視。

苝及其衍生物具有很好的光、熱、化學穩定性、幾乎100％的熒光量子產率（FQY）、窄的熒光發射峰、能夠與細胞背景熒光(395-479nm)分開以及優異的染色性能，已廣泛應用于有機光電器件、激光染料以及生物熒光探針領域。

近年來，此類化合物已經應用于生物領域，如蛋白質靶向標記和細胞特異性標記等，然而水溶性差直接影響了它在這一領域的應用，因此提高此類化合物的水溶性及在水溶液中保持高熒光量子產率具有重要意義。在苝的外圍進行功能基團修飾可以使其最大吸收峰發生很大紅移，能夠更好的避開細胞背景熒光。

樹枝狀大分子由于其精確的三維納米分子結構，分子內部存在著大量空腔、攜帶大量的表面官能團，能夠廣泛應用于生物醫藥領域，如藥物載體和基因載體等。目前所合成的以苝衍生物為熒光核的樹枝狀大分子都具有良好的水溶性、生物相容性、較低的細胞毒性以及優異的細胞標記特性。然而，這些大分子合成步驟繁瑣，需要對中間產物保護與解保護，而保護/去保護的過程往往會反應不完全且伴有副反應，從而導致樹枝狀大分子結構存在缺陷；同時，這些合成的苝衍生物樹枝狀大分子呈現電中性，還沒有報道將它們應用于藥物載體和基因載體等方面。因而，發明一種簡單、高效的制備水溶性的苝類衍生物熒光樹枝狀大分子的方法，對于其在生物醫藥領域（如細胞標記、藥物載體、基因載體等）具有非常重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一類光、熱、化學穩定性好、水溶性好、可生物降解、結構可設計性的苝類熒光樹枝狀大分子，且其具有很好的生物相容性、細胞標記性。首先通過成熟的合成方法制備攜帶四個伯胺官能團的苝熒光核A0，然后通過不對稱單體選擇性“點擊”化學反應，合成不同代數、攜帶不同官能團的熒光樹枝狀大分子。將攜帶不同氨基官能團的熒光陽離子樹枝狀大分子B1、B2和B3分別與活體細胞進行培養，研究其穿透細胞膜的能力；將B1、B2和B3分別與DNA復合，然后與細胞進行培養，研究其運載基因的能力。

合成一類以苝衍生物為熒光核的樹枝狀大分子，包括：（1）攜帶官能基團的苝類衍生物及其類似物（本發明選擇多環芳香族烴的萘，芘，苝，terylene和它們的衍生物作為熒光發射團）與不對稱單體AB（AB型不對稱單體為甲基丙烯酰氧基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酰氧基丙烯酸丙酯或甲基丙烯酰氧基乙氧基乙氧基丙烯酸乙酯）反應后，重復依次加入不對稱單體巰基乙胺和AB，通過AB與巰基乙胺之間選擇性“點擊”化學反應制備苝類熒光樹枝狀大分子。（2）苝熒光樹枝狀大分子端基的官能化修飾：將羥基、PEG鏈功能基團引入到熒光樹枝狀大分子的最外圍末端。（3）水溶性陽離子熒光樹枝狀大分子應用于基因載體，研究B1、B2、B3穿透細胞膜及運載基因能力。其具體制備步驟為：

1.樹枝狀大分子的設計合成

1.1首先以商業熒光化合物四溴苝酐（4Br-PDA）為原料，經過酰胺化反應合成具有高熒光量子產率的苝類衍生物4Br-PBI；然后利用取代反應將氨基引入到苝核的“海島”位置，從而得到攜帶四個伯胺基團的苝類化合物A0（化合物A0屬于苝類熒光發射團系列），其結構式如下：

1.2將化合物A0和甲基丙烯酰氧基丙烯酸乙酯（MAEA）加入反應管中，摩爾比在1：16-1：20之間，在氮氣氛圍下室溫攪拌過夜，然后在48-53℃反應48-56h，得到端甲基丙烯酸酯的第一代熒光樹枝狀大分子（A1）；

1.3將上述A1和巰基乙胺按照摩爾比在1：9-1：11之間溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，在氮氣氛圍下室溫攪拌30-45min后，得到氨基官能化的第一代熒光樹枝狀大分子（B1）；