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[發明專利]一種富硒羊肚菌多糖的制備方法無效

專利信息
申請號: 201310086787.3 申請日: 2013-03-17
公開(公告)號: CN103130909A 公開(公告)日: 2013-06-05
發明(設計)人: 孫永海;丁健峰;付天宇 申請(專利權)人: 吉林大學
主分類號: C08B37/00 分類號: C08B37/00;A01G1/04
代理公司: 長春吉大專利代理有限責任公司 22201 代理人: 齊安全;胡景陽
地址: 130012 吉*** 國省代碼: 吉林;22
權利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關鍵詞: 一種 富硒羊肚菌 多糖 制備 方法
【權利要求書】:

1.一種富硒羊肚菌多糖的制備方法,其特征在于,所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法的步驟如下:

1)富硒羊肚菌的制備

(1)制備培養基:

a.制備斜面培養基;

b.制備深層發酵培養基;

(2)菌種活化:

將所有器具通過紫外線殺菌30min后,在無菌環境下用接種環挑取保藏的粗柄羊肚菌926號,轉接到新鮮的斜面培養基上,在25℃恒溫培養箱中培養24h;

(3)深層發酵:

菌種活化后,取約5mm2大小的菌種10塊接入深層發酵培養基,同時加入的亞硒酸鈉,使深層發酵培養基中硒濃度達到80μg/ml,250mL三角瓶裝料100mL,置于振蕩培養箱中,培養溫度為26℃,振蕩培養箱的振蕩頻率100rpm,培養時間5天,得到富硒羊肚菌菌絲球;

2)富硒羊肚菌胞內粗多糖的提取

(1)富硒羊肚菌菌絲球經清洗、烘干、粉碎、過篩后稱量,按菌絲球與蒸餾水為1:30的比例加入蒸餾水,進行微波協同超聲波輔助提取,然后置于水浴鍋中,在90℃下熱水浸提140min,將浸提液以4000r/min的轉數在離心機中離心15min,取上清液;

(2)上清液經低溫濃縮后,在攪拌下加入3倍體積的95%乙醇,將醇析液在4℃冰箱中靜置12h,采用離心機分離收集沉淀物;

(3)將收集的沉淀物復溶于蒸餾水中,按樣品與Sevag試劑為5:1的比例充分混勻,置于分液漏斗中,靜置20min后棄去下層有機層及兩相界面上的蛋白質變性層,取上層液重復本步驟處理7~8次,直到有機層與水層間無白色膠狀物產生為止,此時上層液體為羊肚菌胞內粗多糖溶液;

(4)取上層羊肚菌胞內粗多糖溶液濃縮、醇沉后收集沉淀物,然后分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次,最后將沉淀物小心刮入稱量皿中,置于40℃真空干燥箱中干燥2h,即得到固態富硒羊肚菌胞內粗多糖;

3)富硒羊肚菌胞內粗多糖的純化

1)采用AB-8大孔樹脂分離,得到富硒羊肚菌多糖洗脫曲線,收集曲線洗脫峰部位的洗脫液,進行下一步純化;

2)Sephadex?G-100凝膠柱層析,繪制富硒羊肚菌多糖洗脫曲線,收集曲線洗脫峰部位的洗脫液,得富硒羊肚菌多糖。

2.按照權利要求1所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法,其特征在于,所述的制備斜面培養基是指:

按重量比采用馬鈴薯20%、加入蒸餾水,將土豆切成小塊煮沸約30min,煮至熟而不爛為止,四層紗布過濾,再按重量比配以葡萄糖2%、瓊脂1.5%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%,加蒸餾水定容至100mL、混合均勻,分裝于試管中,每管裝液量10毫升,121℃滅菌30min,將試管與水平面成10°角放至凈化工作臺中,放涼準備菌種活化使用。

3.按照權利要求1所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法,其特征在于,所述的制備深層發酵培養基是指:

按重量比采用馬鈴薯10%、加入蒸餾水,將土豆切成小塊煮沸約30min,煮至熟而不爛為止,四層紗布過濾,再按重量比配以蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、KH2PO40.05%與MgSO40.05%,加蒸餾水定容,混合均勻,使深層發酵培養基中硒濃度達到80μg/mL,在容量為250mL的三角瓶中裝液量為100mL,121℃滅菌30min,在凈化工作臺中放涼準備深層發酵使用。

4.按照權利要求1所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法,其特征在于,所述的采用AB-8大孔樹脂分離,得到富硒羊肚菌多糖洗脫曲線,收集曲線洗脫峰部位的洗脫液,進行下一步純化是指:

將得到的濃度為1mg/mL的富硒羊肚菌胞內粗多糖溶液離心后吸取上清液,注入AB-8大孔樹脂柱中,每次注入量為5mL,用蒸餾水進行洗脫,蒸餾水的體積為大孔樹脂柱體積的3至5倍,流速控制在2mL/min,每2min收集1管洗脫液,利用硫酸-蒽酮法測定各管洗脫液中的多糖含量,利用UV2300的分光光度計對各管洗脫液進行多糖含量檢測,以洗脫管數作為橫坐標、以吸光度數值作為縱坐標,可以得到富硒羊肚菌多糖洗脫曲線,收集曲線洗脫峰部位的洗脫液,進行下一步純化。

5.按照權利要求1所述的一種富硒羊肚菌多糖的制備方法,其特征在于,所述的Sephadex?G-100凝膠柱層析,繪制富硒羊肚菌多糖洗脫曲線,收集曲線洗脫峰部位的洗脫液,得富硒羊肚菌多糖是指:

將經過AB-8大孔樹脂分離后得到的富硒羊肚菌多糖溶液,離心后取上清液,注入Sephadex?G-100凝膠柱中層析,每次注入量為5mL,用體積為SephadexG-100凝膠柱體積的3至5倍的雙蒸水進行洗脫,流速控制在2mL/min,每2min收集1管洗脫液,利用硫酸-蒽酮法測定各管洗脫液中的多糖含量,利用UV2300的分光光度計對各管洗脫液進行多糖含量檢測,以洗脫管數作為橫坐標、以吸光度數值作為縱坐標,繪制富硒羊肚菌多糖洗脫曲線,收集曲線洗脫峰部位的洗脫液,經透析、醇沉、冷凍干燥后,即得富硒羊肚菌多糖。

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