技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及利用基因工程的方法以酵母為宿主異源共表達(dá)人細(xì)胞色素P450?3A5酶和細(xì)胞色素P450氧化還原酶，以及用人細(xì)胞色素P450?3A5酶代謝咪達(dá)唑侖制備產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖的方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞色素P450酶是重要的藥物代謝I相酶，市場上80%以上的藥物是通過細(xì)胞色素P450酶代謝的。3A亞家族是細(xì)胞色素P450基因家庭的主要成員，主要包括3A4、3A5及3A7幾個成員。細(xì)胞色素P4503A5酶能夠代謝多種藥物如咪達(dá)唑侖（Midazolam）、硝苯地平（Nifedipine）及睪丸激素、孕酮等。

傳統(tǒng)的藥物代謝研究以動物體內(nèi)實驗為主。近幾年來，藥物前期代謝研究進(jìn)入到體外代謝的研究階段：即利用重組CYP450基因在異源表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，建立起體外篩選體系，進(jìn)行體外代謝數(shù)據(jù)和性質(zhì)到體內(nèi)代謝數(shù)據(jù)和性質(zhì)的預(yù)測，使現(xiàn)代新藥研發(fā)具有了高通量、高效率、高準(zhǔn)確性的特點。利用構(gòu)建好的CYP藥物體外篩選系統(tǒng)通過測定藥物代謝的動力學(xué)參數(shù)及其產(chǎn)物性質(zhì)，預(yù)測CYP450酶的體內(nèi)代謝水平，這是目前歐美各國在進(jìn)行新藥申報時必須進(jìn)行的一項研究。

此外，由于代謝活性定量測定時需要大量使用代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，而標(biāo)準(zhǔn)品現(xiàn)在主要用化學(xué)方法合成，不僅反應(yīng)條件復(fù)雜，而且中間產(chǎn)物的分離非常困難。而生物酶具有高度的特異性及較高的產(chǎn)量，因此，利用分子生物學(xué)構(gòu)建的外源基因表達(dá)體系來大量制備代謝物具有重要價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種人細(xì)胞色素P450?3A5酶及NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶共表達(dá)體系以及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一個目的是利用在酵母中表達(dá)的人細(xì)胞色素P4503A5酶代謝藥物咪達(dá)唑侖來制備代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖。

本發(fā)明通過以下方式達(dá)到以上目的：

一種人細(xì)胞色素P450?3A5酶及NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶共表達(dá)體系，其包括宿主酵母，以及定向插入P450氧化還原酶基因和人源P4503A5基因的酵母表達(dá)載體。

所述的宿主酵母為畢赤酵母。

本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建所述人細(xì)胞色素P4503A5酶及NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶共表達(dá)體系的方法，包括以下步驟：

（1）用XbaI酶切質(zhì)粒pBS-2A，分別回收3.0kb?PBS骨架片段和130bp的2A連接肽片段，將3.0kb骨架片段去磷酸化處理，重新連接選擇反向克隆即載體pBS-2A(-)；

（2）將NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因POR定向插入所述載體pBS-2A(-)的BglII及Not?I酶切位點之間，獲得載體pBS-2A-POR；

（3）將人細(xì)胞色素P4503A5酶基因定向插入所述載體pBS-2A-POR的BamH?I及XbaI酶切位點之間，獲得載體pBS-CYP3A5-2A-POR；

（4）用BamH?I和Not?I雙酶切pBS-CYP3A5-2A-POR，將CYP3A5-2A-POR片段定向插入到已經(jīng)用BamH?I和Not?I雙酶切處理過的酵母表達(dá)載體pPIC3.5K中,獲得雙表達(dá)載體pPIC-CYP3A5-2A-POR；

（5）在酵母細(xì)胞中表述上述雙表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了利用所述人細(xì)胞色素P4503A5酶及NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶共表達(dá)體系代謝藥物咪達(dá)唑侖來制備代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑侖的方法。

該方法中，利用電轉(zhuǎn)染的方式將所述人細(xì)胞色素P4503A5酶及NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶共表達(dá)體系轉(zhuǎn)染到宿主酵母細(xì)胞中，誘導(dǎo)人細(xì)胞色素P4503A5酶大量表達(dá)后將溶解的咪達(dá)唑侖加入細(xì)胞中，終濃度為100μM；在加入咪達(dá)唑侖48h后，800g離心10分鐘，棄去細(xì)胞碎處，保留上清；從而制備HPLC純化咪達(dá)唑侖被人源P4503A5代謝的主要產(chǎn)物：1-羥基咪達(dá)唑侖。

所述的宿主酵母優(yōu)選為畢赤酵母。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明所構(gòu)建的人細(xì)胞色素P4503A5酶及NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶共表達(dá)體系可在酵母中異源表達(dá)。此外，本發(fā)明中將人源P4503A5酶及其氧化還原酶基因插入同一個表達(dá)載體。這一載體用于制備代謝物的優(yōu)點首先在于解決了酵母細(xì)胞P450氧化還原酶表達(dá)水平較低的缺陷，其次在于能夠保證被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞同時表達(dá)兩種蛋白。而現(xiàn)有技術(shù)中，當(dāng)使用兩個不同的表達(dá)載體分別攜帶兩個基因時，某些被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可能只表達(dá)其中一種蛋白，因而代謝活性很低甚至沒有活性，最終導(dǎo)致代謝物的產(chǎn)量較低。

附圖說明