[發明專利]人細胞色素P450 3A5酶及NADPH-細胞色素P450氧化還原酶共表達體系無效
| 申請號: | 201310024136.1 | 申請日: | 2013-01-22 |
| 公開(公告)號: | CN103937829A | 公開(公告)日: | 2014-07-23 |
| 發明(設計)人: | 戴仁科;張偉;黃黎珍;鄧繼鋒;王珍玉;謝水林 | 申請(專利權)人: | 中山琺瑪斯醫藥科技有限公司 |
| 主分類號: | C12N15/81 | 分類號: | C12N15/81;C12N15/66;C12P17/18 |
| 代理公司: | 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100 | 代理人: | 曹愛紅;劉婉 |
| 地址: | 528437 廣東省中山市火*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 細胞 色素 p450 a5 nadph 氧化 還原酶 表達 體系 | ||
1.一種人細胞色素P450?3A5酶及NADPH-細胞色素P450氧化還原酶共表達體系,其特征在于包括宿主酵母,以及定向插入P450氧化還原酶基因和人源P450?3A5基因的雙表達載體。
2.根據權利要求1所述的人細胞色素P450?3A5酶及NADPH-細胞色素P450氧化還原酶共表達體系,其特征在于:所述的宿主酵母為畢赤酵母。
3.構建權利要求1或2所述人細胞色素P450?3A5酶及NADPH-細胞色素P450氧化還原酶共表達體系的方法,其特征在于包括以下步驟:
(1)用XbaI酶切質粒pBS-2A,分別回收3.0kb?PBS骨架片段和130bp的2A連接肽片段,將3.0kb骨架片段去磷酸化處理,重新連接選擇反向克隆即載體pBS-2A(-);
(2)將NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因POR定向插入所述載體pBS-2A(-)的Bgl?II及Not?I酶切位點之間,獲得載體pBS-2A-POR;
(3)將人細胞色素P4503A5酶基因定向插入所述載體pBS-2A-POR的BamH?I及XbaI酶切位點之間,獲得載體pBS-CYP3A5-2A-POR;
(4)用BamH?I和Not?I雙酶切pBS-CYP3A5-2A-POR,將CYP3A5-2A-POR片段定向插入到已經用BamH?I和Not?I雙酶切處理過的酵母表達載體pPIC3.5K中,獲得雙表達載體pPIC-CYP3A5-2A-POR;
(5)在酵母細胞中表述上述雙表達載體。
4.利用權利要求1或2所述人細胞色素P450?3A5酶及NADPH-細胞色素P450氧化還原酶共表達體系代謝藥物咪達唑侖來制備1-羥基咪達唑侖。
5.利用權利要求1或2所述人細胞色素P450?3A5酶及NADPH-細胞色素P450氧化還原酶共表達體系代謝藥物咪達唑侖來制備1-羥基咪達唑侖的方法,其特征在于,利用電轉染的方式將所述人細胞色素P450?3A5酶及NADPH-細胞色素P450氧化還原酶共表達體系轉染到宿主酵母細胞中,誘導人細胞色素P450?3A5酶大量表達后將溶解的咪達唑侖加入細胞中,終濃度為100μM;在加入咪達唑侖48h后,800g離心10分鐘,棄去細胞碎處,保留上清;從而制備HPLC純化咪達唑侖被人源P4503A5代謝的主要產物:1-羥基咪達唑侖。
6.根據權利要求5所述的方法,其特征在于,所述的宿主酵母為畢赤酵母。
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