本申請要求獲得我們共同待決的于2011年3月14日提交的美國臨時專利申請系列號61/452,519的優先權。

發明領域

本發明的領域是對微生物的代謝工程，以產生一種或多種化學品，特別是醛，然后將它們分離并在體外轉化成相應的醇。

發明背景

2005年，全世界生產和消耗醛和其它羰基化學品(oxo-chemical)將近960萬公噸。由于需求強烈、產量增加和產能合理化(rationalized?capacity)，2005年全球的產能利用率(capacity?utilization)提高到了84%，而2001年為79%。2001年-2005年，世界醛和其它羰基化學品的產能以1.6%的平均年增長率增加，低于世界的消耗率。在同期，世界的消耗率以平均3.4%的平均年增長率增加。

最常見地，目前醛和其它羰基化學品的生產是通過使用來自原油裂解的石油化學品進行精煉的方法。例如，C3-C15醛的產生是通過石蠟與合成氣(synthesis?gas)的氫甲酰化反應，然后將所生產的醛轉化成相應的醇、酸或其它衍生物。目前，最高需求的羰基化學品是正丁醛，隨后是用于生產增塑劑醇的C6-C13醛，和用于生產去污劑醇的異丁醛和C12-C18醛。

使用代謝工程化的微生物進行微生物合成生物燃料，特別是生產C2-C6醇，在本領域是眾所周知的。例如，在WO94/06924中描述了從碳水化合物進行微生物乙醇生產，美國專利No.8,048,666中報道了從CO2進行乙醇生產。在美國專利申請No.2009/0081746中描述了使用代謝工程化細胞從2-酮酸生產短鏈醇，并且有許多發表的文章涉及從代謝工程化細胞生產異丁醇（例如美國專利Nos.7,851,188和7,993,889,和WO2009/086423,WO2009/149240,WO2010/062597,和WO2010/075504)，在US2011/0250660中描述了使用光合活性微生物從CO2生產醇。Kechun?Zhang等在Proc.Nat.Acad.Sci.(2008),105,no.52:20653–20658中也描述了相似的方法。在美國專利申請No.2011/0201083中描述了使用代謝工程化細胞從2-酮酸生產C5-8醇，在美國專利No.8,097,439中報道了從各種碳源生產脂肪醛。本文通過援引并入這些和在這里所討論的全部其它外部材料的全部內容。當在并入的參考文獻中定義或使用的術語與這里所提供的該術語的定義不一致或相互矛盾時，采用這里所提供的該術語的定義，而不使用該術語在參考文獻中的定義。

不幸的是，這些方法中有很多用來生產的醇的產量仍然相對較低。為了提高至少某些特定醇的產量，可以刪除或抑制內源的醇脫氫酶，或者用重組脫氫酶代替它們，如WO2009/149240A1中所述。盡管這些修飾經常在至少一定程度上符合期望，但是產生了其它的問題。例如，各種醇在高于閾值濃度的情況下對產生醇的細胞是有毒的，從而趨向于對整體產量產生限制。而且，大多數微生物合成的醇可以與發酵培養基完全混溶，需要相當耗能的過程進行分離。然而更糟糕的是，一些醇是共沸混合物，更難以從培養基中分離。

因此，盡管本領域已知有許多生產醛-羰基化學品和相應醇的系統和方法，但是仍然存在一些困難。因此，仍然需要有改進，特別是在使用微生物細胞生產這些化學品的情況下。

發明簡述

本發明涉及使用混合的合成過程來生產醛和醇化合物的設備和方法，所述過程中，代謝工程化的微生物細胞利用碳源產生醛，然后將所述醛連續地或半連續地在汽相中從發酵培養基移出。在特別優選的方面中，代謝工程化的微生物細胞基本上沒有任何醇的產生。醛然后從汽相中冷凝，并在體外被還原成相應的醇。預期的方法有利地克服了各種困難，特別是與產物抑制和從發酵培養基中分離醇相關的各種問題。

在本發明主題的一個方面中，生產醇的方法包括在發酵培養基(優選地具有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、纖維素、半纖維素、甘油、二氧化碳、蛋白質、脂質和/或氨基酸作為碳源)中培育多個微生物細胞的步驟，其中該細胞被遺傳修飾從而與非遺傳修飾的細胞相比具有增加的代謝活性。特別優選的是，增加的代謝活性是丙酮酸或2-酮丁酸向醛的轉化增加，和醇脫氫酶活性降低。細胞產生的醛被連續地或半連續地在汽相中從發酵培養基移出。在另一個步驟中，將醛從汽相中冷凝，在另外一個步驟中，將冷凝的醛還原成相應的醇。