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技術領域

本發明涉及包括使用對于多肽為外源的信號肽的多肽生產方法、包含對信號肽和多肽進行編碼的第一和第二核苷酸序列的核酸構建體、以及包含該核酸構建體的表達載體和宿主細胞。

背景技術

異源蛋白在細菌宿主細胞特別是革蘭氏陽性細菌細胞例如芽孢桿菌（Bacillus）中的重組生產，可以提供更希望得到的用于以商業相關量生產蛋白的載體。

異源蛋白的重組生產通常是通過構建適合宿主細胞的表達盒而完成的，在該表達盒中，編碼蛋白的DNA安置在調控基因的啟動子的表達控制下。將一個或多個拷貝的表達盒導入到宿主細胞的基因組中。然后通過在使表達盒上所含的啟動子適當起作用所必需的誘導條件下培養所轉化的宿主細胞，從而實現異源蛋白的生產。

對于蛋白重組生產的改進通常需要獲得適合于對宿主細胞中蛋白表達進行控制的新的調控序列。本發明的目的是提供改進的方法，使用信號肽序列在革蘭氏陽性宿主細胞中生產多肽。

發明內容

在第一個方面，本發明提供生產分泌型多肽的方法，包括：

（a）在有益于多肽生產的介質中培養革蘭氏陽性宿主細胞，其中該宿主細胞包含核酸構建體，該核酸構建體包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列為外源，第一核苷酸序列的3'端緊接在第二核苷酸序列的上游，第一核苷酸序列選自：

（i）編碼信號肽的核苷酸序列，該信號肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性；或優選與SEQ ID NO:1具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%同一性；

（ii）與SEQ ID NO:10的575～661位所示序列具有至少80%同一性；或優選與SEQ ID NO:10的575～661位所示的序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的核苷酸序列；以及

（iii）在嚴格條件下與具有SEQ ID NO:10的575～661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴格條件定義為，在低于所計算Tm5℃～10℃下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl（pH7.6）、6mM EDTA、0.5%NP-40、1×Denhardt's溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉（sodium monobasic phosphate）、0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5℃～10℃下，在6×SCC+0.1%SDS中洗滌一次（15分鐘），并用6×SSC洗滌兩次（各15分鐘）；以及任選地

（b）從培養介質中分離所分泌的多肽。

在第二個方面，本發明提供一種核酸構建體，其包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列為外源，第一核苷酸序列的3'端緊接在第二核苷酸序列的上游，第一核苷酸序列選自：

（i）編碼信號肽的核苷酸序列，該信號肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性；或優選與SEQ ID NO:1具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%同一性；

（ii）與SEQ ID NO:10的575～661位所示序列具有至少80%同一性；或優選與SEQ ID NO:10的575～661位所示序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的核苷酸序列；以及