技術領域

本發明涉及一種用于高效凝膠排阻色譜（HPSEC）測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品，以及其制備方法和應用。

背景技術

肝素是哺乳動物體內存在的一種糖胺聚糖，由己糖醛酸和葡萄糖胺通過1,4-糖苷鍵連接形成，其相對分子量主要分布在3000~30000之間，是一種混合物。自1937年起，肝素就被作為抗凝劑應用于臨床治療。

大量研究表明，肝素的多種生理活性及其體內過程都有分子量依賴性。首先，肝素的抗凝活性具有分子量依賴性。肝素分子內存在的一種五糖結構能特異性地催化ATⅢ與凝血因子FXa的結合，從而抑制FXa的活性。而ATⅢ對凝血因子FIIa的抑制，除上述五糖結構外，還需要至少13個單糖殘基，即需要至少含18個單糖殘基的肝素分子。因此，分子量較大的肝素的抗凝活性優于分子量較小的肝素，但同時前者引發出血的風險也高于后者。正是基于這一機制，低分子肝素被開發并應用于臨床，其安全性得到顯著提高。第二，肝素的體內清除機制也與其分子量密切相關。肝素進入血液后，可與多種血漿蛋白和血管內皮細胞及巨噬細胞表面受體結合，進而通過巨噬細胞及網狀內皮系統清除，這一清除機制與肝素的分子量及劑量有關，一般來說，高分子量的肝素更容易被清除。因此，肝素的分子量和分子量分布也是影響其代謝的重要因素。第三，肝素在臨床應用過程中可能會引發的重要副反應——血小板減少癥（heparin-induced?thrombocytopenia，HIT）也與肝素的分子量有關。肝素在人體內與血小板因子4（platelet?factor4,PF4）形成復合物，會引發免疫反應，產生肝素依賴性抗體，進而導致血小板活化，引起強烈的血小板聚集，最終造成血小板減少和血栓形成。有研究證明，未分級肝素的免疫原性遠大于低分子肝素。第四，肝素被硫酸魚精蛋白中和的能力也具有分子量依賴性。在使用肝素過程中若發生出血，則需采用硫酸魚精蛋白進行中和。隨著肝素分子量減小，魚精蛋白的中和能力也隨之下降。綜上所述，肝素的分子量和分子量分布是其重要的質控指標，有必要進行常規的監控。

現行的美國藥典、英國藥典、歐洲藥典及中國藥典主要對肝素的鑒別、效價、相關物質、殘留溶劑、重金屬含量等項目做出了規定，而對于肝素的分子量及分子量分布未作出規定，亦未給出檢測方法。因此，制定肝素的分子量和分子量分布質量標準，探索肝素分子量及分子量分布的測定方法對于提高肝素的質量水平具有重要意義。

目前用于測定肝素類分子相對分子量及分子量分布的方法主要有以下幾種：高效分子排阻色譜法（HPSEC）、多角度激光光散射儀法（SEC-MALLS）、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、質譜法及核磁共振法。其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳法耗時較長，操作繁瑣，且小分子量的組分往往因難以著色而被忽略，因此測定結果偏大；質譜法由于離子化過程中容易導致硫酸根的中性化，因此難以得到準確的分子量信息；核磁共振法同樣存在準確度差的問題；多角度激光光散射儀法無需分子量校正標準品，檢測快速準確，但是儀器較為昂貴；高效分子排阻色譜法經濟快速，重現性也較好，且能同時測出分子量分布信息，但是需要肝素相對分子量校正標準品，且該標準品的分子量范圍必須涵蓋供試品中各組分的分子量。

目前已上市的可用于肝素分子量測定的是heparin?polysaccharideⅠ-Ⅵ，其分子量分別為5000Da、7000Da、9000Da、12000Da、15000Da和20000Da。但其分子量范圍無法覆蓋所有的肝素分子，因此測定結果并不準確。也有文獻報道以普魯蘭作為標準品測定肝素的相對分子量，但是由于普露蘭的結構與肝素存在本質的區別，因此測定的相對分子量并不準確。綜上所述，制備可用于肝素相對分子量及分子量分布測定的標準品至關重要。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提出了一種寬分布的肝素相對分子量校正對照品，包括其制備、相對分子量和分子量分布測定方法。本發明具有較高的實用價值，相關方法嚴謹、科學，具有良好的推廣應用前景。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種用于測定肝素及其鹽相對分子量及分子量分布的對照品，由肝素鈉及其分子量寬分布標樣表構成，肝素鈉為固體形式，其經HPSEC-MALLS測定的分子量范圍是3000～40000。

所述對照品的平均分子量在15000～20000。

上述對照品的制備方法如下：