技術領域

本發明涉及自主復制型表達載體pEV及其制備方法與應用，特別是一種適冷宿主菌菌株SM20429的自主復制型表達載體pEV及其制備方法與應用，屬于海洋生物技術技術領域。

背景技術

在生物技術與生物工程領域中，通過將外源基因克隆于表達載體上，轉入到一個合適的宿主細胞中，來達到表達和制備重組蛋白的目的。將這種表達系統應用到工業生產中，可以用于大量制備重組蛋白，達到工業化水平。

地球上的低溫生境非常廣泛，包括深度超過1000米的海洋、極地和許多季節性的寒冷環境等等。這些低溫生境中存在大量的微生物，其中大部分為適冷微生物。由于長期生活在低溫環境下，適冷微生物所產生的酶類等蛋白質往往具有適冷特性，即在低溫下的高催化效率和高溫下的低穩定性。有研究表明，低溫環境有利于適冷蛋白的重組表達，可以更有效地得到有活性的適冷蛋白。雖然大腸桿菌表達系統是目前最成熟和常用的表達系統，但大腸桿菌為中溫菌，最適生長溫度為37℃。在這樣高的溫度下，適冷酶既不穩定，也難以進行活性表達，往往以包涵體的形式存在。而降低大腸桿菌的培養溫度，會降低大腸桿菌的生長速率和表達效率。因此，大腸桿菌表達系統并不是適冷蛋白重組表達的最佳選擇。由于適冷細菌能在低溫下快速生長，所以建立適冷細菌為宿主的表達系統可以對適冷蛋白進行有效的活性重組表達。近些年，國外雖已有開發出適冷細菌表達系統的報道，但仍然沒有商品化的低溫表達系統。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種利用適冷假交替單胞菌進行異源蛋白低溫表達的方法。

名詞解釋

纖維素酶酶活單位(U)定義為35℃下每分鐘釋放1μg葡萄糖所需酶量。

接合轉移頻率定義為接合轉移后每個受體菌所產生的接合轉移子數目。

本發明的技術方案如下：

適冷宿主菌菌株SM20429的自主復制型表達載體pEV，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

上述適冷宿主菌菌株SM20429的自主復制型表達載體pEV的構建方法，步驟如下:

1）以質粒pKNG101為模板，利用EasyTaq?DNA?Polymerase進行PCR擴增，經回收，制得質粒pKNG101的DNA片段，PCR擴增引物序列如下：

OriT1：5’-GCCAGCTCGTCGGTGTAGCT-3’，????SEQ?ID?NO.3

RK2：5’-CAACAACGTTGCCCGGATCG-3’，??????SEQ?ID?NO.4

2）將步驟1）制得的質粒pKNG101的DNA片段和載體pGEM-T?Easy的混合液4μl、5μl連接緩沖液、1μl連接酶混合后，16℃連接過夜，得質粒；

3）以質粒pWD為模板，利用Pfu?DNA?Polymerase進行PCR擴增，PCR擴增引物序列如下：

ZF：5’-AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3’，????SEQ?ID?NO.5

CMR：5’-GGACTAGTGAAGCACACGGTCACACTG-3’，SEQ?ID?NO.6

經純化回收后，用限制性內切酶SpeI和PstI雙酶切處理，回收酶切DNA片段，然后插入到同樣經限制性內切酶SpeI和PstI雙酶切處理后的步驟2）制得的質粒中，制得pOriT-4CM質粒；

4）人工合成含有木聚糖酶啟動子、多克隆位點和His-tag及終止密碼子的DNA片段，在片段的兩端引入SphI和NotI識別位點；用限制性內切酶SphI和NotI雙酶切處理，經純化回收后，插入到同樣經限制性內切酶SphI和NotI雙酶切處理的步驟3）制得的pOriT-4CM質粒中，制得自主復制型表達載體pEV。

所述步驟4）中含有木聚糖酶啟動子、多克隆位點和His-tag的DNA片段制備步驟如下：

選取Pseudoalteromonas?sp.BSi20429的木聚糖酶基因起始密碼子前200bp的DNA序列其后緊跟4個限制性內切酶序列，His標簽（CACCACCACCACCACCAC）和終止密碼子（TAA），人工合成這段DNA片段并在片段兩端引入SphI和NotI識別位點。