技術領域

本發明涉及一種蚓激酶的制備方法。

背景技術

地龍又名蚯蚓，在我國已有四千多年入藥歷史，臨床應用廣泛，療效顯著，無毒副作用。?，F代藥理研究認為地龍有抗凝血、溶血雙重作用，有降壓，抗心律失常，鎮靜，抗驚厥，平咳，抗腦缺血，促進傷口愈合等作用，可治療細菌病毒感染，燒燙傷，癌癥，免疫性等疾病。

近二十年來，世界上許多國家，如美國、日本、加拿大、英國、德國、澳大利亞等，都比較重視蚯蚓的養殖應用和研究工作日本宮崎醫科大學美原恒教授Mihara于1982年報道了從蚯蚓（Lumbricus?rubellus）中提取一組具有纖溶活性的蚓激酶。韓國Ryu用日本Mihara的方法從蚯蚓（Lumbricus?rubellus）中提取出由六個成分組成的具有強纖溶活性的蚓激酶成分。北京大學生命科學院、清華大學、中國科學院生物物理研究所等單位的科研人員通過國家“八五”科技攻關計劃，歷時十余年的艱苦努力，采取現代生物技術從蚯蚓中分離提取有效組分蚓激酶。中國農業大學孫振鈞教授等對蚯蚓的抗菌肽進行了深入研究。

珠海博康藥業有限公司及北京百奧藥業有限公司先后研制出治療心腦血管疾病國家Ⅱ類新藥“蚓激酶腸溶膠囊”，突破了抗栓溶栓藥物不能口服的禁區，成為唯一被國內外認可、首個具有特異性的口服抗栓溶栓生物技術藥物。

我國科研人員在國家自然科學基金、國家重點基礎研究發展計劃“973”計劃的支持下，開始在分子層面上探索這種酶制劑的溶栓機制，以從根本上闡明其作用機理，與日本、韓國等發達國家展開了激烈地競爭。2003年，我國科研人員經過五年多的努力在世界上率先測定了一種具有溶栓活性的蛋白質——蚓激酶的三維結構，從而為在分子層面上了解這一蛋白藥物開啟了大門。這不僅為進一步的藥物設計奠定基礎，也使蚓激酶成為我國最早被測定三維結構的蛋白藥物之一。

在已有的蚓激酶的研究方法和生產工藝中，都存在著蚯蚓原材料的選取較單一，只能用鮮活的蚯蚓作為原材料，工藝過程較復雜，且只能單一的分離提取一種物質，產品的有效成分較低，所含重金屬離子較高，生產的廢渣廢液回收利用率較低，生產成本較高等諸多問題，本方法針對以上問題做了研究和改進，實現了規?；a所必須的條件。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種蚓激酶的制備方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種蚓激酶的制備方法，包括如下步驟：

（1）冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質量3-5倍的體積濃度為50%-95%的乙醇水溶液，調節pH＝5.5-6.5，閃式提取2min-5min；

（2）采用離心機對步驟（1）獲得的提取液進行分離得到沉淀1和上清液1；

（3）向步驟（2）分離得到的沉淀1中加入所述沉淀1質量3-5倍的去離子水，調節pH＝7.0-7.5，閃式提取2min-5min，離心分離，得到上清液2；

（4）向上清液2中，加入所述上清液2質量15%-25%的質量濃度為0.1%-0.5%的聚丙烯酸鈉水溶液，調節pH＝6.5-7.5，攪拌15-30min，離心分離，得到上清液3；

(5)向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質量濃度為17%-23%，調節pH＝6.5-7.5，離心分離，得到上清液4；

（6）向上清液4中補加硫酸銨，使硫酸銨在上清液4中的質量濃度為50%-70%，調節pH＝5.5-6.5；離心分離得到沉淀2；

（7）向沉淀2中加入所述質量2-4倍的去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑TMTH-15調節pH＝8.5-9.5，離心得到上清液5；

（8）將上清液5進行超濾濃縮，以除去上清液5中的硫酸銨，得到超濾濃縮液；

（9）調節超濾濃縮液pH＝7-7.5；冷凍干燥，得到蚓激酶。

所述步驟（1）優選為：冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質量4倍的體積濃度為75%的乙醇水溶液，調節pH＝6.0，閃式提取3min。

所述步驟（3）優選為：向步驟（2）分離得到的沉淀中加入所述沉淀質量4倍的去離子水，調節pH＝7.3，閃式提取3min，離心分離，得到上清液2。

所述步驟（4）優選為：向上清液2中，加入所述上清液2質量20%的質量濃度為0.3%的聚丙烯酸鈉水溶液，調節pH＝7.0，攪拌20min，離心分離，得到上清液3。

所述步驟（5）優選為：向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質量濃度為20%，調節pH＝7.0，離心分離，得到上清液4。