技術領域

本發明涉及一種檢測羊痘病毒血清抗體的試劑盒，具體說是一種應用合成肽抗原包被ELISA板，并在此基礎上制備的檢測羊痘病毒血清抗體的試劑盒。

背景技術

羊痘(Capripox)是由羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)引起可以感染山羊、綿羊及牛的導致山羊痘(variolacaprin，Goatpox)、綿羊痘(variolacaprin，Sheeppox)和牛的疙瘩皮膚病(Lumpy?shindisease)的一種急性、熱性、接觸性傳染病。主要表現為發熱，無毛或少毛部位的皮膚或黏膜發生丘疹和皰疹。羊痘是所有動物痘病中最為嚴重的一種，有較高的病死率，能造成巨大的經濟損失，嚴重影響國際貿易和養羊業的發展。其中羊痘在非洲，土耳其、印度、亞洲部分國家流行廣泛，希臘也有零星分布。所以世界動物衛生組織(OIE)?將該病列為A?類疾病，我國將其列為一類動物疫病。此外，本病在公共衛生方面也有重要意義，中國、瑞典、印度依據流行病學和臨床癥狀都有人類感染羊痘病毒的報道。世界各國都高度重視本病，有本病的國家和地區的易感動物及其有關的產品被世界各國列為嚴格限制進出口的對象。

目前該病缺乏有效的治療藥物，給該病的防控造成了很大的困難，因此羊痘的早期診斷就顯得尤為重要。并且鑒于羊痘病毒對養羊業健康發展的巨大危害，開發一種操作簡單、結果可靠、敏感性高、特異性好、方便基層應用并可產業化生產的血清抗體檢測試劑是預防羊痘傳播的可靠途徑之一。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供一種以羊痘病毒合成肽抗原包被ELISA板為基礎的檢測羊痘病毒血清抗體試劑盒，此試劑盒可快速、特異、準確的檢測羊痘病毒血清抗體，為羊痘病毒的臨床診斷與預防提供參考依據，以克服現有檢測方法存在的特異性不強，敏感性低等不足。

本發明的技術問題采用以下技術方案解決：

一種基于合成肽檢測羊痘病毒血清抗體的試劑盒，包括以下步驟：

a.利用DNAstar(序列分析軟件)軟件設計針對羊痘病毒主要免疫蛋白P32的兩條短肽片段；

b.將步驟a所設計序列采用常規合成肽方法合成肽段；

c.采用方正滴定方法，確定合成肽抗原包被ELISA(enzyme-linked?immuno?sorbent?assay)板的濃度；

d.將陰性、陽性血清用PBS(Phosphate?Buffer?Solution,磷酸鹽緩沖液)稀釋為1:10，1:20，1:40，1:80，1:160　5個稀釋度，進行ELISA檢測，取P/N(陽性/陽性)值最大，OD(optical?delnsity,光密度)值接近1的血清最大稀釋倍數為最適稀釋度，確定陽性血清、陰性血清及待檢血清稀釋度和反應時間；

e.利用棋盤滴定法選擇工作濃度，根據“陽性血清OD值接近1”和“陽性值/陰性值最大”的原則，確定酶標記抗體工作濃度及反應時間。

f.?采集未免疫過羊痘病毒疫苗的健康羊血清，測其OD值并除以標準陰性血清的OD值(S/N，樣品/陰性),?將所得到比值的平均值加標準差作為判定陰/陽性的臨界值。

所述肽段序列如下：

A：PELKSDNDIFYKKVDTVKDFKNSDVNFFLKDKKDDI

B:?YKLEKELKLNRQVLNDSSKYILHNTKYLSKKRANEMKN。

所述步驟c確定合成肽最佳包被濃度為0.3ug/孔，其中A:B的比例為1:1(A為0.15ug/孔，B為0.15ug/孔)。

所述步驟d的標準陽性血清、標準陰性血清和待檢血清樣品稀釋度的體積比均為1:20；標準陽性血清、標準陰性血清和待檢血清最佳反應時間為45min。

所述步驟e酶標抗體工作濃度為：用PBS將兔抗羊IgG-HRP(辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白G)作1:400體積比稀釋為酶標記抗體的最佳稀釋度；酶標抗體最佳反應時間為45?min。

所述步驟f確定的判定標準為：S/N值≥2.20為陽性，S/N值≤1.65為陰性，S/N值介于2.20和1.65之間者為可以，應重測，重測后S/N≥2.20判為陽性，S/N值＜2.20判為陰性。

本發明的有益效果在于設計并合成了針對羊痘病毒P32蛋白的肽段，該合成肽的生物學活性接近于羊痘病毒天然蛋白，并且比天然蛋白更易操作，可替代羊痘病毒直接作為檢測用抗原，在此基礎上制備檢測羊痘病毒血清抗體的ELISA方法，該方法具有快速、敏感、特異等特點，為大規模的羊痘流行病學調查提供可靠的技術支持。

具體實施方式