技術領域

本發明涉及抗腫瘤試劑制備領域，尤其涉及一種抗腫瘤試劑淡紫醌霉素lavendamycin及其甲酯的生產工程菌株構建方法及它們的制備方法。

背景技術

鏈黑菌素是一個由絨毛鏈霉菌（Streptomyces?flocculus）產生的具有獨特喹啉環結構的抗腫瘤抗生素。其抗腫瘤活性良好，是一種廣譜抗腫瘤抗生素，對腦癌、頸癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌，特別是對白血病、淋巴瘤和黑素瘤具有很好的療效。鏈黑菌素的藥理作用是：可選擇性地抑DNA合成，主要作用于S期，一個分子的鏈黑菌素可與2000個分子的脫氧核苷酸穩定地結合，并能使瘤細胞染色體斷裂，使已形成的DNA降解.由于具有較大的骨髓毒性，因此很少單獨用藥用于臨床。鏈黑菌素含有四個環，其中三個環幾乎處于同一個平面，而第四個環與這個平面幾乎呈垂直狀態。

淡紫醌霉素（lavendamycin）是從鏈霉菌（S.lavendulea?strain?C22030）分離鑒定的氨基醌類化合物，具有與鏈黑菌素相類似的結構，但是其化學結構含有五個環，這五個環幾乎處于同一平面。淡紫醌霉素具有與鏈黑菌素相近的抗腫瘤活性和抗腫瘤譜，但是比鏈黑菌素低得多的毒性。自1981年淡紫醌霉素被報道以來，僅僅只有一例關于其產生菌的報道，目前該產生菌被國外公司保存，且產量低，文獻報道在8升發酵培養基中僅獲得0.3mg淡紫醌霉素。而淡紫醌霉素甲酯則是淡紫醌霉素利用化學合成手段通過與甲醇發生酯化反應獲得的抗生素，目前并沒有天然微生物產生淡紫醌霉素甲酯的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供利用鏈黑菌素產生菌通過生物技術操作制備淡紫醌霉素lavendamycin及其甲酯的方法。鏈黑菌素產生菌Streptomyces?flocculusCGMCC4.1223的菌種來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，寄存來源是上海醫藥工業研究院。參考文獻：中國科學院微生物研究所放線菌分類組，《鏈霉菌鑒定手冊》，1975,P202-205,科學出版社，北京。本發明通過對柔毛鏈霉菌Streptomyces?flocculus?CGMCC4.1223進行針對鏈黑菌素生物合成基因簇中雙氧化酶的選擇性失活突變，得到相應的雙氧化酶失活突變菌株，從該突變株的發酵液中分離到淡紫醌霉素（lavendamycin）及其甲酯化合物。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

第一方面，本發明涉及一種淡紫醌霉素的制備方法，包括如下步驟：

A、以鏈黑菌素原始產生菌柔毛鏈霉菌Streptomyces?flocculus?CGMCC4.1223為出發菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇；

B、對所述鏈黑菌素生物合成基因簇中的雙氧化酶stnBl基因進行選擇性失活，獲得stnBl基因失活突變菌株ΔstnBl；

C、對所述突變菌株ΔstnBl進行發酵，將發酵液離心，離心后的濾液調整pH值至9～10，用不溶于水的中等極性有機溶劑A反復萃取，取水相濾液；

D、調整所述水相濾液pH值至4～5，用所述不溶于水的中等極性有機溶劑反復萃取，收集中等極性有機溶劑相B，濃縮得到粗提物B，對所述粗提物B進行純化，即得。該淡紫醌霉素，其結構式如式（Ⅰ）所示：

優選地，所述不溶于水的中等極性有機溶劑A為乙酸乙酯、乙醚、氯仿或正丁醇。

優選地，步驟C中，所述不溶于水的中等極性有機溶劑A與離心后的濾液的體積比為1:3～2:1。

優選地，步驟D中，所述不溶于水的中等極性有機溶劑A與水相濾液的體積比為1:3～2:1。

優選地，步驟D中，所述純化為：用pH值為11～13的堿性水溶液溶解所述粗提物B并離心，收集上清液；向上清液中滴加鹽酸至出現沉淀；離心棄去上清，沉淀凍干后加入乙腈溶解，經半制備性PHLC（ZORBAX?XDB-C18,9.2*250mm，5A粒徑）色譜,以乙腈水溶液洗脫，接收對應的吸收峰，合并餾分后放置-20℃以下，待有沉淀析出后低溫離心，棄去上清，凍干沉淀，即得所述淡紫醌霉素。

優選地，所述乙腈水溶液中乙腈的體積濃度為20%～100%。

優選地，所述堿性水溶液為0.1～1M?NaOH溶液。

第二方面，本發明還涉及一種淡紫醌霉素甲酯的制備方法，包括如下步驟：

A、以鏈黑菌素原始產生菌柔毛鏈霉菌Streptomyces?flocculus?CGMCC4.1223為出發菌株，克隆得到鏈黑菌素生物合成基因簇；