技術領域

本發明涉及活化淋巴細胞的擴增、凍存以及復蘇方法，屬于生物技術領域。

背景技術

機體的免疫系統具有識別和殺傷腫瘤細胞的能力，已經獲得了大量研究數據的證實。近年來，腫瘤特異性細胞免疫治療在臨床實踐中顯示了非常令人興奮的療效。2002年，RosenbergSA等人在Science雜志報道了利用體外大量擴增的腫瘤特異性腫瘤浸潤淋巴細胞過繼回輸方法，他們在體外篩選出具有病人自身惡黑細胞特異性殺傷作用的腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs），大量擴增后回輸給自體病人。在這種方法中，經過體外IL-2和抗CD3抗體的聯合作用，數量高達1011的、腫瘤細胞高度特異的多種腫瘤抗原特異性識別的TILs被回輸至經清除淋巴細胞化療的病人體內，這些細胞以CD3+CD8+CD56-的T細胞為主。在接受治療的13例病人中，6例病人完全緩解（CR，腫瘤完全消失），4例病人部分緩解（PR，腫瘤消失50%以上，無新發腫瘤）。這10例病人均發生明顯的腫瘤縮小和/或消失。在Dr.Rosenberg的長期臨床實踐中，他們發現，利用來源于腫瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞進行晚期惡性黑色素瘤的治療，其有效率可達50%以上。Greenberg和Yee?C的研究組在利用具有腫瘤特異性殺傷能力的CD8+T細胞克隆進行的治療中發現，多次使用這類細胞、聯合使用化療藥或不使用化療藥進行晚期惡性黑色素瘤病人的治療，可以使部分病人腫瘤長期穩定、明顯延長病人生存期。

然而，在這些特異性細胞免疫治療過程中，存在著特異性細胞培養擴增的技術難題。首先，對于腫瘤浸潤淋巴細胞來說，（1）需要解決腫瘤組織體外原代培養的技術難題，以鑒定所獲得的腫瘤浸潤淋巴細胞對自體腫瘤有殺傷能力；（2）對于生命關鍵性器官所發生的腫瘤，需要鑒定特異性浸潤T淋巴細胞所識別是否為組織相關性抗原，以避免自身免疫病的發生。所謂組織相關性抗原，指的是在腫瘤中高表達，在正常對應的組織器官中低表達的腫瘤抗原。在免疫治療黑色素瘤時，可能會發生白癜風的副作用，而對如肝、腦等生命重要器官，由于這類抗原誘導的特異性殺傷細胞所可能產生的自身免疫病，使腫瘤浸潤淋巴細胞進行特異性免疫治療的應用受到限制。其次，對于使用抗原和樹突狀細胞（DC）進行體外腫瘤抗原特異性的淋巴細胞克隆來講，（1）需要通過leukophresis獲取大量的外周血單個核細胞以獲得DC和飼養細胞；（2）每一個目的抗原均須進行體外抗原刺激，以獲得腫瘤特異性T細胞克隆，技術復雜、耗時長、細胞用量大，限制了多種抗原特異性T細胞的獲得。另外，活化的淋巴細胞需多次輸注才能達到較好的治療效果，多數醫療單位利用血細胞分離機采集單個核細胞，而這種采集方法價格昂貴，多次采集給患者帶來心理及身體的痛苦。如果一次采集的單個核細胞可以凍存，當患者治療需要時，復蘇并誘導為活化的淋巴細胞，就為患者節約了費用，減輕了痛苦。

傳統的體外擴增淋巴細胞的方法，是以CD3抗體作為淋巴細胞激活劑，并采用大劑量的IL-2，這樣雖然在短期內得到大量活化的T細胞，但很容易導致活化誘導的細胞死亡，最終難以獲得足夠數量的細胞毒性T淋巴細胞，并且含有大量的CD4+CD25+Treg細胞（見具體實施方式14）。

小劑量的抗CD3單抗可以活化靜止的T細胞，誘導其產生殺傷腫瘤的作用，這種殺傷作用既包括對腫瘤細胞的直接殺傷，又包括分泌相關的細胞因子對腫瘤細胞產生間接殺傷，還可通過誘導腫瘤細胞發生凋亡對其產生作用。另一方面加入抗CD3單抗后可以激活腫瘤細胞的凋亡途徑，導致凋亡細胞的數量增加，而這種凋亡作用主要通過Fas途徑產生。

但大劑量加入CD3單抗進行培養時并未產生直線增加的殺傷和誘導作用，相反出現凋亡數量下降的現象，甚至出現對T細胞的抑制作用，壞死及凋亡細胞的數量均下降，這可能是因為T細胞受體(TCR)的數量有限，在過量的抗CD3單抗作用下，不但不能激活T細胞，反而會因受體表面被封閉而無法活化。

發明內容

為了解決了現有活化淋巴細胞制備（主要是指CIK細胞）純度低，增殖力低的缺點。并解決病人因為多次使用細胞而需多次采血的問題。本發明聯和使用抗CD3單抗、抗CD28單抗、IL-2、IL-15等共同培養，另外通過免疫磁珠技術去除在培養過程中產生的CD4+CD25+Treg細胞，使得培養的細胞種類純度更高。本發明凍存以及復蘇的方法，可以解決患者為連續使用活化的CD3+CD8+為主的淋巴細胞而需多次采血的問題。