[發明專利]一種以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的擴增、凍存及復蘇方法無效
| 申請號: | 201210339583.1 | 申請日: | 2012-09-13 |
| 公開(公告)號: | CN102839153A | 公開(公告)日: | 2012-12-26 |
| 發明(設計)人: | 高恒亮;郭棟 | 申請(專利權)人: | 濟南泰生生物技術有限公司 |
| 主分類號: | C12N5/0783 | 分類號: | C12N5/0783;A01N1/02 |
| 代理公司: | 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105 | 代理人: | 韓百翠 |
| 地址: | 250000 山東省濟南市*** | 國省代碼: | 山東;37 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 cd3 cd8 為主 活化 淋巴細胞 擴增 復蘇 方法 | ||
1.一種以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的擴增方法,其特征是,
(a)將外周血血樣中分離出的單個核細胞在含有淋巴細胞激活劑和細胞因子IL-2的培養基中培養;所述淋巴細胞激活劑為抗CD3抗體和抗CD28抗體,抗CD3抗體的終濃度為0.1-100ng/ml;抗CD28抗體的終濃度為0.1-50ng/ml;所述IL-2終濃度為100U/ml至5000U/ml;
(b)將(a)步驟中培養得到的淋巴細胞用mini?MACS磁珠分選去除CD4+CD25+Treg細胞;
(c)將(b)步驟中培養得到的淋巴細胞在含有細胞因子IL-2和IL-15的培養基中培養;所述IL-2終濃度為50-500U/ml,IL-15的終濃度為10-500ng/ml;
(d)收集(c)步驟中得到的淋巴細胞用于回輸或凍存。
2.如權利要求1所述的擴增方法,其特征是,所述步驟(a)抗CD3抗體的終濃度為1-75ng/ml,抗CD28抗體的終濃度為2-30ng/ml;IL-2的濃度為2000-4000U/ml。
3.如權利要求1所述的培養方法,其特征是,步驟(c)中IL-2的終濃度為200-500U/ml,IL-15的終濃度為200-400ng/ml。
4.如權利要求1所述的擴增方法,其特征是,所述步驟(a)中使用的淋巴細胞激活劑還含有激活劑PHA和/或IFN-r;所述PHA的終濃度為1-100ng/ml,而IFN-r的終濃度為100-2000U/ml。
5.如權利要求1所述的擴增方法,其特征是,所述步驟(c)還含有細胞因子IL-7、IL-12、IL-21中的一種或幾種;所述IL-7的終濃度為10-200ng/ml,IL-12的終濃度為5-100ng/ml,IL-21的終濃度為1-200ng/ml。
6.如權利要求1所述的擴增方法,其特征是,所述培養基為RPMI-1640培養基、DMEM培養基或者AIM-V培養基。
7.權利要求1-6中任意一項所擴增的以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的凍存方法,其特征是,
(e)取權利要求1-6的生長在對數期的以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞進行收集,收集方法為:以300-2000r/min的速度離心,得到沉淀細胞;
(g)將在(e)步驟中得到的細胞加入凍存液使細胞濃度為0.1×107-5×107/ml;將制備的細胞懸液轉入凍存管中;
(h)將(g)步驟中得到的凍存管放于程序降溫盒中在零下20℃放置1-5小時,再轉于-80℃冰箱放置16-48小時,轉入液氮罐中長期凍存。
8.如權利要求7所述的凍存方法,其特征是,所述步驟(e)中對數期是指淋巴細胞總數為原始分離得到淋巴細胞總數的2-100倍;所述步驟(e)中以CD3+CD8+為主的淋巴細胞的收集為:取細胞放于離心管中,以400-600r/min的離心速度離心10分鐘,除去上清液;所述步驟(g)中所用凍存液為胎牛血清與DMSO按照9:1的體積比配制,或者培養基與DMSO按照9:1的體積比配制,或者為胎牛血清和培養基的混合液體與DMSO按照9:1的體積比配制,所述培養基為RPMI-1640培養基、DMEM培養基或者AIM-V培養基;所述步驟(g)為在零下20℃放置2-3小時,再轉于-80℃冰箱放置20-24小時。
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