技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種單克隆雜交瘤的制備方法。

背景技術(shù)

自從Kohler和Milstein發(fā)明單克隆抗體技術(shù)以來(lái)，該技術(shù)不斷發(fā)展完善，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域疾病的診斷、治療以及科學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求越來(lái)越大。但制備單克隆抗體一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)而且也是最重要環(huán)節(jié)就是陽(yáng)性雜交瘤的克隆建系。

融合后篩選出的雜交瘤細(xì)胞群系不完全是純系，仍屬于異質(zhì)性的細(xì)胞群。因此，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)雜交細(xì)胞群體進(jìn)一步純化，以便獲得同質(zhì)性的細(xì)胞群體。最常用的純化方法就是雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。

克隆化培養(yǎng)是指單個(gè)雜交細(xì)胞在一個(gè)獨(dú)立的空間增值，最終擴(kuò)增為一群相對(duì)較純的，且能夠穩(wěn)定表達(dá)某些特定性狀的細(xì)胞群體的培養(yǎng)方式。用于這種方法的細(xì)胞群體由于均來(lái)源于同一個(gè)祖先細(xì)胞，故可認(rèn)為其遺傳特性較為一致。常見的克隆化培養(yǎng)方法有以下五種：

1：有限稀釋法

這是一種比較傳統(tǒng)的方法，即將ELISA檢測(cè)出的陽(yáng)性孔，稀釋到4-8細(xì)胞/mL。取20mL放入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。這樣約有36%的孔含有1個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到20~80%孔底時(shí)，用ELISA檢測(cè)，將檢測(cè)出的陽(yáng)性孔按照上述方法再克隆，直到所有具有雜交瘤的孔中都呈陽(yáng)性，即陽(yáng)性率需達(dá)到100%。此亞克隆方法的缺點(diǎn)有：1、對(duì)細(xì)胞的計(jì)數(shù)要求非常高；2、由于陽(yáng)性的克隆容易被陰性的克隆所排擠，導(dǎo)致陽(yáng)性克隆容易丟失；3、由于需要反復(fù)克隆再克隆，細(xì)胞培養(yǎng)的工作量大、操作繁瑣、克隆效率低。因此，它不能適應(yīng)需要建立幾十株以上雜交瘤的功能性抗體篩選的研究。但用甲基纖維素制成半固體培養(yǎng)基可以克服以上方法的局限性，直接進(jìn)行克隆化的培養(yǎng)，提高了工作效率。

2：甲基纖維素半固體培養(yǎng)基一步法

國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道選用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法篩選雜交瘤細(xì)胞，此法是將細(xì)胞接種于半固體培養(yǎng)基里使細(xì)胞以分散的方式單個(gè)生長(zhǎng)，增值后的細(xì)胞后代不能遷移，只是在祖先細(xì)胞鄰近形成細(xì)胞集落，然后挑出這些細(xì)胞集落再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得較純的雜交瘤細(xì)胞群體的方法。半固體培養(yǎng)基最常見的有軟瓊脂培養(yǎng)基和甲基纖維素培養(yǎng)基。但這個(gè)方法應(yīng)用并不廣泛，主要原因是在甲基纖維素半固體培養(yǎng)環(huán)境下，雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到限制，其生長(zhǎng)狀態(tài)不如液體培養(yǎng)基好，原因可能是因?yàn)榧谆w維素限制雜交瘤細(xì)胞葡萄糖的利用，增加了氨基酸的消耗。由于融合后的細(xì)胞膜較脆弱，其最適的培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，因而不容易在半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因而用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基一步法需要加入昂貴的細(xì)胞因子等來(lái)促進(jìn)雜交瘤的存活，才有利于簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，但是很多細(xì)胞因子的成份都是商業(yè)化的，因此其缺點(diǎn)就是增加了成本。軟瓊脂半固體培養(yǎng)基法，此方法由于瓊脂粉中存在有對(duì)細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，容易導(dǎo)致細(xì)胞長(zhǎng)出來(lái)的較少，同時(shí)由于瓊脂在室溫下操作容易凝固，故需要在較高的溫度下加入細(xì)胞，由于溫度控制不好，可能直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3：凝血素半固體培養(yǎng)基法

此種方法需要使用凝血因子使得培養(yǎng)基凝固，使得雜交瘤長(zhǎng)出來(lái)的較少，因此不太常用。

4：?jiǎn)渭?xì)胞顯微技術(shù)

這一方法是通過(guò)顯微操作分離單個(gè)雜交細(xì)胞，然后將其植入單個(gè)培養(yǎng)空間，最終獲得單個(gè)雜交細(xì)胞的后代。但用于顯微操作的雜交細(xì)胞應(yīng)具備可辨認(rèn)的獨(dú)特形態(tài)學(xué)特征，并且需借助倒置顯微鏡。

5：熒光激活分選

此方法是采用激活分選儀進(jìn)行的。方法是用熒光物質(zhì)標(biāo)記特選的雜交細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液通過(guò)分選以上的細(xì)胞噴嘴，可形成單個(gè)細(xì)胞液滴。此法的基本原理是被熒光標(biāo)記的待選細(xì)胞在激光照射下能夠發(fā)射熒光，再通過(guò)調(diào)整儀器參數(shù)使發(fā)射不同熒光的單個(gè)細(xì)胞液滴帶不同電荷，這些具有不同電荷的細(xì)胞液滴在電場(chǎng)中的偏轉(zhuǎn)角度不同，因此利用這一原理通過(guò)電腦處理，可分離不同雜交瘤。加入特定的熒光物質(zhì)，這些熒光物質(zhì)能夠特異性的在陽(yáng)性雜交瘤的周圍形成激光激發(fā)下的明亮的熒光光環(huán)，從而使得陽(yáng)性雜交瘤的篩選和亞克隆一步到位，大大節(jié)約了時(shí)間和勞力，但是由于其專利的技術(shù)和高昂的設(shè)備及試劑費(fèi)用阻礙著其成為一種常規(guī)的單抗生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種成本低、效率高的單克隆雜交瘤的制備方法。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

（1）融合：使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤細(xì)胞與抗原免疫后的淋巴細(xì)胞，得融合細(xì)胞；

（2）培養(yǎng)：將融合細(xì)胞接入次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶（HAT）液體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得雜交瘤細(xì)胞；