[發(fā)明專利]一種單克隆雜交瘤的制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210280494.4 | 申請日: | 2012-08-08 |
| 公開(公告)號: | CN102864125A | 公開(公告)日: | 2013-01-09 |
| 發(fā)明(設計)人: | 周軍;王玉燕;馮展波 | 申請(專利權)人: | 南京巴傲得生物科技有限公司 |
| 主分類號: | C12N5/20 | 分類號: | C12N5/20;C12R1/91 |
| 代理公司: | 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204 | 代理人: | 肖明芳 |
| 地址: | 210036 江蘇省南京市棲霞區(qū)*** | 國省代碼: | 江蘇;32 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 單克隆 雜交瘤 制備 方法 | ||
1.一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)融合:使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤細胞與抗原免疫后的淋巴細胞,得融合細胞;
(2)培養(yǎng):將融合細胞接入HAT液體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),得雜交瘤細胞;
(3)篩選:將雜交瘤細胞上清液采用間接ELISA篩選,得陽性雜交瘤細胞;
(4)亞克隆:將陽性雜交瘤細胞接入亞克隆半固體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),得單個雜交瘤細胞集落;
(5)擴大培養(yǎng):取單個雜交瘤細胞集落的細胞接入胎牛血清培養(yǎng)液中于二氧化碳培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng),即得單克隆雜交瘤細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于:步驟(1)中,所述淋巴細胞為小鼠脾細胞,所述骨髓瘤細胞包括sp2/0細胞或NS-1細胞。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于:步驟(1)中,所述淋巴細胞與骨髓瘤細胞的細胞數(shù)量比為(10-2):1,所述聚乙二醇的分子量為1000-6000,所述聚乙二醇水溶液的體積分數(shù)為40-60%。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于:步驟(1)中,還可以將融合細胞接入含胎牛血清培養(yǎng)液中于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于:所述胎牛血清培養(yǎng)液的胎牛血清體積百分比為10%-20%,所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%,培養(yǎng)溫度為25-37℃,培養(yǎng)時間為16-24h。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于:步驟(2)中,HAT液體培養(yǎng)基的HAT的體積分數(shù)為2-5%,培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%,培養(yǎng)溫度為25-37℃,培養(yǎng)時間8-12天。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于:步驟(4)中,所述亞克隆半固體培養(yǎng)基的配方為:
谷氨酰胺I水溶液????????????????0.1-1.0mL,體積分數(shù)0.25%-2.5%;
非必需氨基酸水溶液?????????????0.1-1.0mL,體積分數(shù)0.25%-2.5%;
β-巰基乙醇???????????????????0.1-1.0mL,體積分數(shù)0.25%-2.5%;
次黃嘌呤-胸腺嘧啶水溶液????????????0.1-1.0mL,體積分數(shù)0.25%-2.5%;
青霉素及鏈霉素水溶液???????????????0.1-1.0mL,體積分數(shù)0.25%-2.5%;
胎牛血清水溶液?????????????????????5-10mL,體積分數(shù)12.5%-25%;
甲基纖維素?????????????????????????0.1-1g,2.5mg/ml-25mg/ml;
DMEM高糖水溶液?????????????????????25-35mL,體積分數(shù)62.5%—87.5%。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于:步驟(4)中,所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%,培養(yǎng)溫度為25-37℃,培養(yǎng)時間為7-14天。
9.根據(jù)權利要求1所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法,其特征在于:步驟(5)中,所述培養(yǎng)液為體積百分比的10%-20%胎牛血清培養(yǎng)液,所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%,培養(yǎng)溫度為25-37℃,培養(yǎng)時間為3-5天。
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