技術領域

本發明涉及一種檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒及檢測方法。

背景技術

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious?bovine?rhinotracheitis，IBR），是由牛皰疹病毒Ⅰ型引起的牛的一種接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、上呼吸道及氣管粘膜發炎以及生殖道感染、結膜炎等為主要特征。一般牛群臨床發病率約20%-30%，但血清反應陽性率要高得多，由于本病有潛伏感染和機體長期排毒的性質，抗體陽性牛實際上就是隱性帶毒者。IBRV具有典型的泛嗜性，能侵襲多種器官和組織，引起多種臨床癥狀，給養牛業造成較大的經濟損失，是國際動物貿易中進口種牛、牛精液時的重點檢疫對象和進口國應高度關注的動物疫病之一，我國農業部將其列為二類動物疫病。

牛傳染性鼻氣管炎幾乎遍布世界各地，我國主要奶牛進口國澳大利亞、新西蘭等國均有發生。該病于1955年在美國科羅拉多州的育肥菜牛被首次報道，我國于1980年從新西蘭進口的奶牛體內首次分離到IBRV，隨后的血清學調查證實我國多個省市的牛群中均有一定比例的IBR抗體陽性牛存在。近幾年從國外進口奶牛中也不同程度的檢出抗體陽性牛和分離出該病毒。因此清除IBR抗體陽性牛，排除潛伏感染動物是控制IBR最好最簡單的方法，但關鍵問題是要率先建立一種檢測IBR陽性牛的方法。目前，國內已有的針對牛傳染性鼻氣管炎檢測的國家標準和行業標準，包括經細胞培養分離病毒，病毒核酸的PCR檢測、病毒抗體的血清中和試驗和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。檢驗過程繁瑣，病毒檢測需要5d-6d才能報告陽性結果，血清抗體檢測方法中最快速的ELISA方法也需要2h-4h。而且現行檢測IBR抗體的試劑多為從國外進口的ELISA診斷試劑盒，價格昂貴推高了檢測成本，同時還需要酶標儀等特定儀器、操作者的實驗技能和一定的試驗環境條件，難以在基層臨床中推廣。

發明內容

為了解決上述實際問題，本發明的目的在于提供一種檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒及檢測方法，本發明具有特異、敏感、快速可靠、效果直觀、結果容易判斷等優點，且不需要特殊儀器設備，檢測樣品的檢測結果可以保存備查。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明首先提供了一種檢測IBR病毒抗體的金標免疫滲濾試劑盒，所述試劑盒的組成包括：

a）牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原；

b）金標記羊抗牛抗體；

c）洗滌液；

d）封閉液。

所述牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原的制備方法如下：采用無血清培養方法在牛腎傳代細胞上培養牛傳染性鼻氣管炎病毒，將牛傳染性鼻氣管炎病毒的培養液反復凍融3次，5000?r/min離心30?min，取上清液裝入透析袋中，置于0.01?mol/L?pH7.4?PBS?緩沖液中透析，直至培養液透明清亮為止，然后將透析液濃縮。

所述無血清培養方法采用不添加血清的基礎培養基DMEM/F12?（1:1），培養條件為37℃、5％CO₂。

所述封閉液為含10g/L酪蛋白、0.5mL/L?吐溫-20（Tween-20）的0.01?mol/L?pH7.2的PBS溶液或含5g/L酪蛋白、0.5mL/L?Tween-20的0.01?mol/L?pH7.2的PBS溶液；所述洗滌液為含0.5ml/L?Tween-20的0.01mol/L?pH7.2的PBS緩沖液。

本發明還提供了一種利用所述金標免疫滲濾試劑盒檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的方法，先將牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原點樣于硝酸纖維素膜上，用封閉液封閉后加待測血清樣品，洗滌液洗滌，然后加金標記羊抗牛抗體，洗滌液洗滌，觀察結果，若點樣處出現紅色斑點即為陽性，若不出現紅色斑點即為陰性。

在試劑盒內硝酸纖維素膜上對稱位置點樣如下：一點為牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原1μL作為檢測點，另一點為葡萄球菌A蛋白1μL作為質控點；室溫干燥后加入100μL封閉液；待封閉液干燥后，加入待檢血清50-100μL；滲入后加入洗滌液洗滌；加金標記羊抗牛抗體100μL；滲入后加入洗滌液洗滌，洗去未結合的金標記羊抗牛抗體；5?min-10min?內若在硝酸纖維素膜上點樣處出現紅色斑點即為陽性，若不出現紅色斑點即為陰性，作為試驗有效的標志，質控點應出現紅色斑點，否則該膜無效，應重新點制膜。

所述點樣時牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原濃度為0.95?mg/mL－1.81mg/mL，葡萄球菌A蛋白濃度為1?g/?L。