技術領域

本發明涉及疫苗的檢測技術，特別涉及一種新的流感疫苗中甲醛含量的測定經方法。

背景技術

流感疫苗用于預防流行性感冒。適用于任何可能感染流感病毒的健康人，每年在流行季節前接種一次，免疫力可持續一年。流感疫苗是預防和控制流感的主要措施之一。可以減少接種者感染流感的機會或者減輕流感癥狀。

流感疫苗不能包治感冒，注射流感疫苗可以預防流行性感冒病毒，但不能防止普通性感冒的發生，只能起到緩解普通性感冒癥狀、縮短感冒周期等作用。而且，即使注射了流感疫苗也要在半個月之后才能產生抗體，達到預防的目的。

流感疫苗分為：全病毒滅活疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗，每種疫苗均含有甲1亞型、甲3亞型和乙型3種流感滅活病毒或抗原組份。這三種疫苗的免疫原性和副作用相差不大。

甲醛是疫苗生產中常用的病毒滅活劑，具致癌性，殘留的游離甲醛，若隨疫苗注入機體后，會產生制激性反應。流感裂解疫苗中含有的甲醛需要嚴格控制其含量，以往在流感疫苗的檢測方法上，國內采用品紅亞硫酸法(中國藥典)，但此方法的最低檢測限僅為25ug/ml，參考歐洲藥典建立的乙酰丙酮分光光度法最低檢測限為1ug/ml，仍高于亞單位流感疫苗甲醛含量。酚試劑分光光度法以其更高的靈敏度已應用于食品，環保等行業檢測，歐洲藥典EP7.0中提供的疫苗中甲醛含量檢測方法為酚試劑分光光度法，此方法甲醛與酚試劑的反應是在偏酸的水溶液，反應時間為1小時，因此選擇一種將酚試劑分光光度法用于亞單位流感疫苗中甲醛含量的快速檢測勢在必行。

發明內容

本發明目的在于，提供一種酚試劑分光光度法檢測亞單位流感疫苗中甲醛含量，通過優化酚試劑，鹽酸，硫酸鐵銨濃度，反應時間和反應溫度確立最佳反應條件，以1支疫苗即可完成檢測，且甲醛與酚試劑的反應是在磷酸鹽緩沖液中進行，20分鐘即達到最大反應程度，縮短了測定時間。

本發明的方法包括以下步驟：

步驟1，甲醛標準溶液的配制；

步驟2，流感疫苗測試液的配制；

步驟3，用酚試劑分光光度法測定甲醛標準溶液和流感疫苗測試液的數值；

步驟4，根據數值計算流感疫苗測試液中的甲醛含量，

其中，步驟2流感疫苗測試液的配制方法為：

A、取疫苗和酚試劑反應，其中反應體系中酚試劑的量為0.04～0.8mg/ml，反應5-15min；

B、向反映體系中加入鹽酸，調節PH值至2-6；

C、向反應體系中加入硫酸鐵銨溶液，硫酸鐵銨的重量百分含量為0.05～0.16％，反應15-25min。

其中，優選：體系中酚試劑的量為0.34mg/ml；鹽酸調節反映體系PH值至5；反映體系中硫酸鐵銨的重量百分含量為0.1％；反應溫度30-40℃，優選35℃。

其中所述步驟1甲醛標準溶液的配制；是將甲醛溶液用PB依次稀釋定容至10ug/ml，5ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0.2ug/ml，0.1ug/ml，現用現配。

其中PB溶液是含有0.68％磷酸二氫鉀，0.14％氫氧化鈉，PH?7.2的溶液，配制方法見中國藥典2010版二部附錄XV?D。

優選的，所述流感疫苗測試液的配制如下：取400-600ul流感疫苗，加入200-400ul水，加入1.5-2ml?0.5-2mg/ml的酚試劑，混勻后30-40℃水浴5-15min，然后依次加入0.5-2ml?0.1-0.3mol/L的鹽酸，0.3-0.7ml?10.5-2％(w/v)硫酸鐵銨溶液，混勻后30-40℃水浴15-25min，冷卻至室溫得到流感疫苗測試液。

特別優選的，5ml反應體系，流感疫苗測試液的配制如下：取500ul流感疫苗，加入300ul水，加入1.7ml?1mg/ml的酚試劑，混勻后35℃水浴10min，然后依次加入1ml?0.2mol/L鹽酸，0.5ml?1％(w/v)硫酸鐵銨溶液，混勻后35℃水浴20min，冷卻至室溫得到流感疫苗測試液。

其中所述步驟3用酚試劑分光光度法測定甲醛標準溶液和流感疫苗測試液的數值；是在波長為629nm處測定分光光度值。

其中所述步驟4的計算是通過標準曲線法計算流感疫苗測試液中的甲醛含量。

本發明的測定方法是經過篩選獲得的，篩選過程如下：

1.材料與方法