技術領域

本發明涉及的是一種生物技術領域的提高青蒿素含量的方法，特別是一種轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技術

青蒿(Artemisia?annua?L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能。可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。

目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同種植環境和種植品種中其平均含量在青蒿葉片干重的0.01-1％，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大，產量低，成本高，不具有可行性。有人嘗試用組織培養和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多數研究在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的可行性也不高。

經對現有技術文獻檢索發現，Waleerat?Banyai等在《Plant?Cell?Tissue?and?Organ?Culture》(植物細胞組織器官培養)，2010年103卷255-265頁發表了題為“Overexpression?of?farnesyl?pyrophosphate?synthase(FPS)gene?affected?artemisinin?content?and?growth?of?Artemisia?annua?L.”(“過量表達法尼基焦磷酸合酶基因能影響青蒿中青蒿素的含量及青蒿的生長”)的論文，報道通過過最表達法尼基焦磷酸合酶(farnesyl?pyrophosphate?synthase，FPS)，使轉基因青蒿中青蒿素的含量提高了2.5-3.6倍，但仍然只有1.3％左右。不過，植物基因工程為提高青蒿中青蒿素的含量提供了一條可行的方法。

現有技術中青蒿醛Δ11(13)還原酶(artemisinic?aldehydeΔ11(13)double?bond?reductase，DBR2)是青蒿素合成途徑中的一個關鍵酶，是青蒿素代謝工程的重要靶點。采用基因工程手段，用關鍵酶基因DBR2轉化青蒿，將打破青蒿素生物合成的限速瓶頸，獲得青蒿素高產的青蒿植株，為規模化生產青蒿素提供一條新途徑。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發明涉及的關鍵酶基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、青蒿素提取及含量測定用于本發明，建立了穩定提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用青蒿大規模生產青蒿素奠定堅實的基礎。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下具體步驟：

(1)采用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因DBR2；

(2)把所述DBR2基因連結于表達調控序列，構建含DBR2基因的植物表達載體；

(3)將所述含DBR2基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得含所述DBR2基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；

(4)利用所述含DBR2基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的整合外源目的基因DBR2的轉基因青蒿植株；

(5)對所述轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。

優選的，在所述步驟(1)中，所述基因克隆方法包括以下步驟：提取青蒿基因組總RNA，將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉錄酶XL反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列，設計擴增出完整編碼框的上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ?ID?NO.2所示的DNA序列，所述下游引物為SEQ?ID?NO.3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點以便構建表達載體，以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增后進行測序。