[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201210014227.2 | 申請(qǐng)日: | 2012-01-17 |
| 公開(公告)號(hào): | CN102676578A | 公開(公告)日: | 2012-09-19 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 唐克軒;沈乾;陳韻斐;王濤;吳韶龑;陸續(xù) | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 上海交通大學(xué) |
| 主分類號(hào): | C12N15/84 | 分類號(hào): | C12N15/84;A01H5/00 |
| 代理公司: | 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236 | 代理人: | 郭國中 |
| 地址: | 200240 *** | 國省代碼: | 上海;31 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | dbr2 基因 提高 青蒿 青蒿素 含量 方法 | ||
1.一種轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,包括如下具體步驟:
(1)采用基因克隆方法獲得青蒿關(guān)鍵酶基因DBR2;
(2)把所述DBR2基因連結(jié)于表達(dá)調(diào)控序列,構(gòu)建含DBR2基因的植物表達(dá)載體;
(3)將所述含DBR2基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌,獲得含所述DBR2基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株;
(4)利用所述含DBR2基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿,獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的整合外源目的基因DBR2的轉(zhuǎn)基因青蒿植株;
(5)對(duì)所述轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量進(jìn)行HPLC-ELSD測(cè)定,篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,在所述步驟(1)中,所述基因克隆方法包括以下步驟:提取青蒿基因組總RNA,將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶XL反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA,根據(jù)SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上游引物和下游引物,所述上游引物為SEQ?ID?NO.2所示的DNA序列,所述下游引物為SEQ?ID?NO.3所示的DNA序列,并在所述上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以便構(gòu)建表達(dá)載體,以所述的第一鏈cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,在所述步驟(2)中,所述構(gòu)建含DBR2基因的植物表達(dá)載體包括以下步驟:先構(gòu)建中間載體pMDT18-DBR2,再用XmaI和SacI酶切中間載體pMDT18-DBR2和表達(dá)載體FSN,回收DBR2基因片段和FSN載體大片段,連接轉(zhuǎn)化,挑取單克隆,提取質(zhì)粒做PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,所述構(gòu)建中間載體pMDT18-DBR2包括以下具體步驟:通過高保真酶擴(kuò)增DBR2基因前后分別引入XmaI和SacI酶切位點(diǎn)的基因全長,通過連接酶連接到pMDT18載體上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,在所述步驟(4)中,所述轉(zhuǎn)化包括以下步驟:外植體的預(yù)培養(yǎng);農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng);抗性再生植株的篩選。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,所述預(yù)培養(yǎng)包括以下步驟:青蒿種子用75%乙醇浸泡1min,再用20%NaClO浸泡20min,無菌水沖洗3-4次,用無菌吸水紙吸干表面水分,接種于無激素的MS固體培養(yǎng)基中,25℃光照培養(yǎng),即可獲得青蒿無菌苗,待苗長至5cm左右后,剪取無菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,所述共培養(yǎng)包括以下步驟:將所述葉片外植體轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中,滴加含活化好的所述含DBR2基因植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液,使外植體與菌液充分接觸,28℃暗培養(yǎng)3天,以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對(duì)照。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,所述篩選包括以下步驟:將所述共培養(yǎng)3天的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基上于25℃光照培養(yǎng),每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次,經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽,將所述生長良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根,即可獲得Kan抗性再生青蒿植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,在所述步驟(4)中,所述PCR檢測(cè)包括以下步驟:設(shè)計(jì)合成DBR2基因的引物;進(jìn)行DNA擴(kuò)增;紫外線下觀察,若目的條帶為陽性,則該株系即為所述轉(zhuǎn)基因青蒿植株。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,在所述步驟(5)中,所述HPLC-ELSD測(cè)定包括以下條件:所用色譜柱為C-18反相硅膠柱,流動(dòng)相選用體積比為70∶30的甲醇∶水,柱溫30℃,流速1.0mL/min,進(jìn)樣量20μL,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度40℃,放大系數(shù)為7,載氣壓力5bar。
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