技術領域

本發明涉及微生物的分子生物學領域，特別提供了一種從釀酒酵母細胞中高效提取高分子量基因組的方法。通過該方法提取的基因組可以滿足許多分子生物學分析的需要。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)為低等真核生物，與同屬真核生物的動物和植物細胞在結構上有很多相似性。早在1996年釀酒酵母的基因組測序工作就已完成，是被人們了解最多的微生物之一。釀酒酵母具有易于培養且繁殖迅速的特點，經常被用來作為研究真核生物的工程菌。釀酒酵母被廣泛應用于食品生產和基因工程領域。目前對釀酒酵母的研究已經上升到了分子水平，隨著對其生理機制研究的深入，釀酒酵母的一些功能蛋白的基因經常被用來在其它工程菌中克隆、表達。研究中對于釀酒酵母基因組的需求，無論是在量或質上都大為提高。

目前實驗室提取酵母基因組DNA的方法主要有試劑盒法、液氮研磨法、化學試劑法。但這些方法往往只能適用于部分酵母，缺乏通用性，對于釀酒酵母基因組的提取，效果往往不夠理想。由于缺乏專門針釀酒酵母這一特定酵母基因組的提取方法，本專利通過多次優化實驗流程和試劑配方，總結出一種從釀酒酵母細胞中高效提取高分子量基因組的方法。

發明內容

為了解決現有酵母基因組提取方法的不足，本發明提供了一種從釀酒酵母細胞中高效提取高分子量基因組的方法，包括破壁、去除組蛋白和RNA、抽提、沉淀、溶解，具體工藝過程如下：

破壁：破解細胞壁與細胞膜是提取基因組DNA的基礎，由于釀酒酵母細胞壁結構比細菌細胞壁更為堅固、厚實，一般的溶菌酶并不能有效的分解釀酒酵母的細胞壁，因此本專利使用lyticase來破除細胞壁。

用500μl的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40μl、1000U/ml的lyticase和1μlβ-巰基乙醇，混勻后37℃孵育3h。

去除組蛋白和RNA：對破壁后的細胞使用蛋白酶k和RNase去除染色體上的組蛋白和不需要的RNA。

8000r/min?1min離心棄上清(加速要慢)，加500μlTE緩沖液(pH8.0)，混勻后加50μl、10％SDS，加入10μl、200mg/ml蛋白酶k，再加入10μl、10g/ml?RNase，37℃孵育1h。

抽提：加入500μl平衡酚，顛倒混勻、靜置5min，8000r/min離心1mmin。移取上層加入250μl平衡酚和250μl氯仿∶異戊醇(24∶1)顛倒混勻、靜置5min，加500μl氯仿，顛倒混勻、靜置5min，8000r/min離心1min，取上層水相。

沉淀：取上層水相，加入2倍體積無水乙醇，-20℃放置1h。12000r/min離心10min。

溶解：棄上清并置于超凈臺吹干，加入50μl?ddH₂O溶解DNA。

所述山梨醇緩沖液為：1mol/L，pH?7.5；

所述TE緩沖液為：1mol/LTris·Cl，pH?8.0，0.5mol/L?EDTA，0.5mol/L檸檬酸，加水至1000ml；

Lyticase(1000U/ml)蛋白酶k(200mg/ml)RNase(10g/ml)。

本發明從影響釀酒酵母基因組提取的質和量入手，將破壁和去除蛋白、RNA的過程分開，分別采用不同的緩沖液及添加還原劑來保證破壁的效率和除去雜質的效果。在工藝過程上進行了更細致的優化，增加了抽提的次數，使基因組更加完整并提高了純度，能更好地滿足分子生物學的需求。

附圖說明

圖1：1、2、3為本方法提取的基因組；4為用蝸牛酶法；5為SDS反復凍融法；M為λ-HindIII?digestDNA分子量標準。

具體實施方式

實施例1：

挑取釀酒酵母BY4742單菌落培養至OD≈3，收集濕重約1g的新鮮菌體，山梨醇洗滌一次；

加入500μl的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40μl、1000U/ml的lyticase和1μlβ-巰基乙醇，混勻后37℃孵育3h；

8000r/min?1min離心棄上清(加速要慢)，加500μl?TE緩沖液(pH8.0)，混勻后加50μl、10％SDS，加入10μl、200mg/ml蛋白酶k，再加入10μl、10g/ml?RNase，37℃孵育1h；