[發明專利]去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A、純化方法及用途有效
| 申請號: | 201110455047.3 | 申請日: | 2011-12-30 |
| 公開(公告)號: | CN102516373A | 公開(公告)日: | 2012-06-27 |
| 發明(設計)人: | 朱濤;宇學峰;程昆明;邵忠琦 | 申請(專利權)人: | 天津康希諾生物技術有限公司 |
| 主分類號: | C07K14/315 | 分類號: | C07K14/315;C07K1/14;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/19 |
| 代理公司: | 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201 | 代理人: | 陸藝 |
| 地址: | 300457 天津市濱海新區經濟技術開發*** | 國省代碼: | 天津;12 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 去除 同源性 肺炎 鏈球菌 表面 蛋白 純化 方法 用途 | ||
1.去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A,其特征是所述去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A是序列表SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列。
2.權利要求1的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A在制備預防肺炎鏈球菌感染的疫苗的應用。
3.表達權利要求1所述去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的基因,其特征是所述表達序列表SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ?ID?No.3所示;所述表達序列表SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ?ID?No.4所示。
4.含有表達人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體,其特征是將序列表SEQ?ID?No.3所示基因插入到表達載體PET9a中得到重組載體1;或將序列表SEQ?ID?No.4所示基因插入到表達載體PET9a中得到重組載體2。
5.含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株,其特征是將所述重組載體1導入到大腸桿菌E.Coli?BL21中或將所述重組載體2導入到大腸桿菌E.Coli?BL21中得到含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株。
6.去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A的純化方法,其特征是包括如下步驟:
(1)發酵權利要求4制備的含有人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白A基因重組載體的菌株;
(2)將所述菌株發酵液7200rpm離心15分鐘,收集沉淀,用pH=8.0?20毫摩爾/升?tris重懸沉淀,勻漿細胞破碎,8000rpm離心30分鐘,取上清液;
(3)批次吸附:將Q?sepharose?fast?flow與步驟(2)獲得的上清液混合攪拌吸附2小時,緩沖體系為pH=8.0的20毫摩爾/升tris;以3-5倍所述步驟(2)獲得的上清液體積的pH=5.4的濃度為20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將吸附產物洗脫,以3-5倍樣品體積的含350-450毫摩爾/升的氯化鈉pH=5.4的濃度為20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫,得到Elute產物;
(4)將Elute產物用pH=5.4的20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理;
(5)Q柱準備:以3-5倍的柱體積的pH=5.4的20毫摩爾/升的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡Q柱;
(6)上樣:將步驟(4)得到的產物上樣Q柱;
(7)以3-5倍柱體積的含有50-150毫摩爾氯化鈉的pH=5.4的20毫摩爾/升?檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫,再用3-5倍柱體積的含有160-300毫摩爾/升?氯化鈉的pH=5.4?20毫摩爾/升?檸檬酸檸-檬酸鈉緩沖液Elute洗脫;
(8)將步驟(7)獲得的產物以pH=4.0?20毫摩爾/升?檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液超濾脫鹽處理;
(9)SP柱準備:以3-5倍的柱體積的pH=4.0?20毫摩爾/升?檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液平衡SP柱;
(10)上樣:將步驟(8)獲得的產物上樣SP柱;
(11)以3-5倍柱體積的含有250-350毫摩爾/升?氯化鈉的pH=4.0?20毫摩爾/升?檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液wash洗脫,再用3-5倍柱體積的含有450-550毫摩爾/升?氯化鈉的pH=4.0?20毫摩爾/升?檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液Elute洗脫;得到純度90%以上的去除人同源性的肺炎鏈球菌表面蛋白。
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