技術領域

本發明涉及微生物生物技術領域，涉及發酵產谷胱甘肽的重組菌株及其制備方法。

背景技術

谷胱甘肽(GSH)是生物體內一種重要的非蛋白巰基化合物，在醫學和化妝品，食品加工，蛋白純化等領域有著廣泛的應用[Sies?H.(1999)Free?Rad?Biol?Med.27，916-921；Henry?Jay?Forman?et，al，(2009)Molecular?Aspects?of?Medicine?30，1-12；鄭云朗(1995)生物學通報30，22-24；Castro，VM.et，al(1993)，Biochem?J?292，371-377]。

自上世紀70年代日本協和公司(Kyowa?Hakko?Kogyo?Co.)使用發酵法生產谷胱甘肽工業化以后，發酵法生產GSH就成為其工業生產研究的主要方法[Sakato，K.and?Tanaka?H.1992，Biotechnol.Bioeng.40，904-912]。為此，上世紀七十年代后，各國開始對生物法合成GSH進行了大量研究，發表了大量文章和申請并公布了一系列相關專利[Kimura?A.(1986)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，33，1-51，Nanjo，H.，Yamashita，K.，et.，al(1986)公開特許公報61-52299；Tezuka，H.，Otake，Y.，Yabushi，et.，al(1987)公開特許公報62-275685；Christine，L.，Ulf，S.(1989)Eur.Pat.Appl.EP?300168；王紹校，(2005).中國學位論文全文數據庫；饒志明等(2007).應用與環境生物學報，13：257-260；饒志明等(2007).食品與發酵工業.33：1-4；蔡宇杰等，食品與機械，23，16-19；US?Patent?6902912；US?Patent?4598046；US?Patent?4582801；JP19890032584；WO2004/003217?A1；EP1539982；US?Patent?20050239164，CN200810019761.6]。其中，發酵菌株的選育主要集中在酵母(如Saccharomyces?cervisiae、Pichia?pastoris、Candida?utilis)和大腸桿菌等微生物，通常的方法是在育種中利用基因重組技術使微生物細胞表達GSH相關合成相關基因谷氨酰半胱氨酸合成酶gsh1和谷胱甘肽合成酶gsh2基因，打破轉錄調控，使細胞內GSH合成酶活增加，從而提高GSH產量。

谷胱甘肽作為細胞內重要的多功能因子，其合成與調控等機理復雜。

Alfafara等人研究表明，胞內半胱氨酸的濃度是GSH合成產量的限制因素[Alfafara?et，al.1992，Appl.microbiol.biotechol.36，358-540]。發酵添加半胱氨酸可以直接提高GSH的產量[Wen，S.et，al.2004，Enzyme?Microbial.tech.35，501-507]。

細胞內高濃度GSH對谷胱甘肽合成酶1(gsh1)的競爭抑制以及谷胱甘肽積累后胞內毒性是提高發酵法谷胱甘肽含量以及產業化最大瓶頸[P?G?Richman，et，al.1975，J.Biol.Chem.250：1422-1426；Srikanth，C.V.et，al.2005，Curr?Genet.47，345-358]。

為了解決胞內GSH對gsh1合成酶的競爭抑制和GSH高濃度胞內毒性，李華鐘等人構建了帶有GSH?I和GSH?II基因的質粒轉化后的大腸桿菌，通過發酵處理使得生產GSH分泌到細胞外，發酵產量高達7g/L[李華鐘等(2001)微生物學報，41：16-23]。雖然他們構建的工程菌發酵生產GSH是目前報道最高的產量，但發酵過程還需要添加甲苯等有毒化合物，不利于工業化。2004年Perone?G.G.等人通過表達gshI和gshII基因和突變相關基因使得酵母菌發酵生產GSH分泌到細胞外，但專利報道搖瓶產量僅為胞內0.06um/L，胞外0.03umol/L左右[WO2004/003217?A1]。

發明內容

本發明首先提供一種分泌生產谷胱甘肽的重組菌株。

本發明還提供所述重組菌株的制備方法。

本發明還提供所述重組菌株在發酵生產谷胱甘肽中的應用。

本發明提供的生產谷胱甘肽的重組菌株，其谷胱甘肽胞外向胞內運輸蛋白基因失活，并且表達外源谷胱甘肽胞內向胞外運輸蛋白基因。