技術領域

本發明涉及一種利用單克隆抗體技術制備堿性磷酸酶的方法。?

背景技術

堿性磷酸酶是一種能夠將對應底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等。堿性磷酸酶也是目前免疫診斷試劑產品最常用的標記酶之一，堿性磷酸酶作為標記酶的優點是穩定性高和靈敏度高，缺點為成本高。?

堿性磷酸酶主要應用于分子生物學和酶聯免疫分析中：分子生物學中主要用于核酸的去磷酸化，酶聯免疫分析中應用最多的是ELISA，在ELISA中應用堿性磷酸酶系統，其敏感性一般高于HRP系統，空白值也較低。但由于較難得到堿性磷酸酶高純度制劑，因此其價格比HRP高，從而限制了其應用范圍。另外，核酸序列分析、DNA重組技術以及臨床檢驗中都需要利用此酶。目前工業上一個普遍的應用是作為檢驗牛奶的巴斯滅菌的標志。?

國內多采用兔肝或豬腎、豬小腸、乳牛胎盤等，經勻漿、正丁醇抽提、硫酸胺分段鹽析或者有機溶劑沉淀，獲得堿性磷酸酶制品。這種提取方法不能快速提取大量堿性磷酸酶，而且提取的堿性磷酸酶純度不高、活性不高。國外曾用單克隆抗體技術從胎牛基質小泡中提取堿性磷酸酶。?

發明內容

本發明的目的是提供一種利用單克隆抗體技術制備堿性磷酸酶的方法，此方法能夠快速提取大量堿性磷酸酶，所提取的堿性磷酸酶純度高、活性高。?

為實現上述目的，本發明的技術方案是：一種利用單克隆抗體技術制備堿性磷酸酶的方法，通過以下步驟制備：（一）制備腹水：用堿性磷酸酶免疫Balb/c小鼠，再用免疫鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆獲得分泌抗堿性磷酸酶單克隆抗體的雜交瘤細胞，體內接種雜交瘤細胞，制備腹水；（二）制備堿性磷酸酶免疫親和層析柱；（三）純化抗堿性磷酸酶單克隆抗體：將步驟（一）得到的腹水加入堿性磷酸酶免疫親和層析柱，PBS洗凈柱子，甘氨酸洗脫液洗脫結合蛋白，加Tris緩沖液調整pH值，透析，收集純化的抗堿性磷酸酶單克隆抗體。（四）制備抗堿性磷酸酶單克隆抗體的免疫親和層析柱；（五）提純堿性磷酸酶：?將用于提取堿性磷酸酶的動物組織粉碎，勻漿，離心取上清液，依次經澄清過濾器、混合纖維素濾膜過濾，所得濾液經抗堿性磷酸酶單克隆抗體免疫親和層析柱，依次用PBS、生理鹽水、硫氰酸鉀洗脫液洗脫柱子并分步收集。?

所述Balb/c小鼠為8～10周齡雌性小鼠。?

步驟（一）中免疫Balb/c小鼠時，初次免疫時，堿性磷酸酶標準品50μg，加無菌水定容至0.1ml，再加入0.1ml福氏完全佐劑，乳化后腹腔注射小鼠，2周后第二次免疫，堿性磷酸酶標準品50μg，加無菌水定容至0.1ml，再加入0.1ml福氏不完全佐劑，乳化后腹腔注射小鼠，3周后第三次免疫，堿性磷酸酶標準品50μg，加無菌水定容至0.1ml，腹腔內注射小鼠，?2～3周內第四次免疫，注射堿性磷酸酶標準品150μg。?

步驟（五）中用于提取堿性磷酸酶的動物組織為小牛腸。?

本發明利用單克隆抗體技術制備的堿性磷酸酶具有純度高、活性高，且利用本發明提供的方法能快速提取大量堿性磷酸酶，非常適合批量生產。?

附圖說明

圖1為SDS-PAGE電泳圖譜：?

M：?標準分子量蛋白mark

1：?堿性磷酸酶標準品

2：?1/25?濃度的樣品

3：?1/20?濃度的樣品

具體實施方式

一、制備腹水?

1、動物的選擇

選取8～10周齡雌性Balb/c小白鼠。

2、免疫?

初次免疫：堿性磷酸酶標準品50μg，加無菌水定容至0.1ml，再加入0.1ml福氏完全佐劑，乳化后腹腔注射小鼠。第二次免疫：2周后，堿性磷酸酶標準品50μg，加無菌水定容至0.1ml，再加入0.1ml福氏不完全佐劑，乳化后腹腔注射小鼠。第三次免疫：3周后，堿性磷酸酶標準品50μg，加無菌水定容至0.1ml，腹腔內注射小鼠，5～7天后采血測其效價。第四次免疫：2～3周內，腹腔內注射堿性磷酸酶標準品150μg。3天后取脾融合。

3、細胞融合?

準備骨髓瘤細胞：

骨髓瘤細胞SP2/0用?RPMI1640，20%小牛血清培養基培養，細胞處于對數生長的中期，細胞濃度達到3×10⁵～5×10⁵/ml，細胞處于最佳狀態。

準備飼養細胞：?