技術領域

本發明涉及一種多參照內標法定量基因表達量的方法，屬于分子生物學領域。

背景技術

反轉錄聚合酶鏈式反應（Reverse?Transcription?Polymerase?Chain?Reaction）(RT-PCR)是指一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增的技術。對基因表達量的檢測，有多種方法。有直接測定RNA的Northern?Blot法；有基于反轉錄聚合酶鏈式反應的、通過對PCR終產物進行監測的凝膠圖像分析法；以及基于反轉錄聚合酶鏈式反應的、通過對PCR過程進行監測的實時定量RT-PCR。Northern?Blot是用RNA探針雜交的方法進行定量，不需要反轉錄，但需要用RNA量較大，制作探針較復雜，而且要得到理想的效果也比較難；實時定量RT-PCR，程序簡單，容易得到好的結果，但儀器較貴，試劑成本大。傳統的RT-PCR凝膠圖像分析法，以RNA用量少、操作簡單、儀器和試劑相對于實時定量RT-PCR便宜，仍然為很多科學研究者用來定量基因表達量。

傳統的RT-PCR凝膠圖像分析法，采用圖像分析軟件來比對凝膠圖像上的看家基因和被考察的基因的DNA譜帶，雖然能得出了相對表達量，但誤差極大，甚至出現相反的結論。這是由于圖像的像素點并不完全與DNA的拷貝數成簡單的直線相關，而且被考察的基因的原始拷貝數與看家基因的拷貝數相差甚遠，常常相差4-5個數量級，因而僅用凝膠圖像上的看家基因和被考察的基因的DNA譜帶的一對圖譜中的圖像參數進行計算來獲得被考察的基因的相對表達量，誤差極大。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，提供一種多參照內標法定量基因表達量的方法，以克服傳統的RT-PCR凝膠圖像分析法因參照內標少，對基因表達量定量誤差大等缺陷。

本發明為實現上述目的，采用的技術方案包括以下步驟：（1）將總RNA設置成一系列的倍數，并分別為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以這些互補DNA為模板，以看家基因設計出的引物為引物，以常規的統一反應體系進行PCR擴增，形成多個參照內標擴增產物；同時，將以稀釋到一定倍數的RNA為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以此互補DNA為模板，分別以被考察的基因設計出的引物和看家基因設計出的引物為引物，以上述常規的統一反應體系進行PCR擴增，形成目標基因擴增產物和看家基因擴增產物；（2）將目標基因擴增產物和看家基因擴增產物以及多個參照內標擴增產物同時電泳，獲得凝膠圖像；（3）將凝膠圖像處理成灰度圖像，經過亮度和對比度的調整，獲得表征圖像；（4）將表征圖像上的多個參照內標擴增產物的DNA圖譜的像素點與總RNA的倍數擬合成方程：????????????????????????????????????????????????，這里的X為一個參照內標擴增產物的DNA圖譜區的像素點值，Y為對應的看家基因的倍數，a,?b分別為方程的常數；（5）將表征圖像上的目標基因擴增產物和看家基因擴增產物的DNA圖譜的像素點分別帶入方程，分別計算出目標基因擴增份額Y_目標和看家基因擴增份額Y_看家；（6）目標基因擴增份額Y_目標和看家基因擴增份額Y_看家的比值，即為目的基因的相對表達量GE_目標。

本發明的優點為：本發明采用多參照內標同時擴增，根據凝膠圖像上的多參照內標擴增產物制定標準曲線，來反演看家基因和被考察的基因的份額，從而來獲取被考察基因的表達量。測定出的基因表達量數據具有很高的可靠性和精度，且操作簡單、儀器和試劑相對便宜。

具體實施方式

本發明的實施例：步驟一、將常規方法提取的待測生物樣本的總RNA設置成一系列的倍數，如1.00、0.1、0.01、0.001以及0.0001。分別以各種倍數的總RNA為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以這些互補DNA為模板，以看家基因設計出的引物為引物，以常規的統一反應體系進行PCR擴增，形成多個參照內標擴增產物。與此同時，將以稀釋到一定倍數，如0.1倍的總RNA為模板，逆轉錄成為相應的互補DNA，再以此互補DNA為模板分別以被考察的基因設計出的引物和看家基因設計出的引物為引物，以上述常規的統一反應體系，進行PCR擴增，形成目標基因擴增產物和看家基因擴增產物。

步驟二、將目標基因擴增產物和看家基因擴增產物以及多個參照內標擴增產物同時電泳，獲得凝膠圖像。