技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于重組細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種FGFR4高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

受體酪氨酸激酶(receptor?tyrosine?kinase，RTKs)是最大的一類酶聯(lián)受體，它既是受體又是酶，能夠同配體結(jié)合，并將靶蛋白的酪氨酸殘基磷酸化。所有的RTKs都是由三個(gè)部分組成的：含有配體結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單次跨膜的疏水α螺旋區(qū)、含有酪氨酸蛋白激酶(RTK)活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。受體酪氨酸激酶在沒有同信號分子結(jié)合時(shí)是以單體存在的，并且沒有活性；一旦有信號分子與受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，兩個(gè)單體受體分子在膜上形成二聚體，兩個(gè)受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的尾部相互接觸，激活它們的蛋白激酶的功能，結(jié)果使尾部的酪氨酸殘基磷酸化。磷酸化導(dǎo)致受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的尾部裝配成一個(gè)信號復(fù)合物(signaling?complex)。剛剛磷酸化的酪氨酸部位立即成為細(xì)胞內(nèi)信號蛋白(signaling?protein)的結(jié)合位點(diǎn)，可能有10～20種不同的細(xì)胞內(nèi)信號蛋白同受體尾部磷酸化部位結(jié)合后被激活。信號復(fù)合物通過幾種不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，擴(kuò)大信息，激活細(xì)胞內(nèi)一系列的生化反應(yīng)；或者將不同的信息綜合起來引起細(xì)胞的綜合性應(yīng)答(如細(xì)胞增殖)。?

蛋白酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是多種類型腫瘤細(xì)胞區(qū)別于相應(yīng)正常細(xì)胞的關(guān)鍵特征之一。已知導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的癌基因約50％的表達(dá)產(chǎn)物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它們的異常表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。此外，酪氨酸激酶及受體的異常表達(dá)還與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤新生血管的生成和腫瘤化療的耐藥性密切相關(guān)。?

蛋白酪氨酸激酶受體是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，生長因子(GF)作為配體與其結(jié)合后，刺激GFR單體二聚化(dimerization)，催化?ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到酪氨酸殘基上，使其細(xì)胞膜胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)(TKD，tyrosine?kinase?domain)特定位點(diǎn)酪氨酸發(fā)生磷酸化，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，造成細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)生物功能變化，尤其在介導(dǎo)惡性腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用。?

人類成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast?growth?factor?receptor?FGFRs)家族和它們的20多個(gè)配基對細(xì)胞在生理狀況下進(jìn)行多方位的調(diào)控，包括細(xì)胞生長、分化、移行、血管生成等。FGF/FGFR信號傳遞是血管新生、胚胎發(fā)育、骨骼形成、傷口愈合、纖維化及腫瘤形成的重要原因之一。目前已確定了四種由獨(dú)立基因編碼的人FGFRs，即FGFRl～FGFR4。?

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管形成，只有在新生血管形成以后，腫瘤才能生長，并向周圍組織浸潤，進(jìn)入血液循環(huán)向其他部位轉(zhuǎn)移，成纖維細(xì)胞生長因子受體4(FGFR4)在胚胎組織、成人微小血管壁和乳腺癌、胰腺癌、腎癌等組織中有較高表達(dá)，而且特異性表達(dá)于成熟的肝細(xì)胞。?

近年來，眾多學(xué)者開展FGFR4在腫瘤生長、發(fā)生過程中的研究工作，研究結(jié)果表明：FGFR4在黑色素瘤、前列腺癌、頭頸癌、乳腺癌、肝癌中表達(dá)量較高，同時(shí)，F(xiàn)GFR4介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞化療耐藥性(chemoresistance)，因此，F(xiàn)GFR4對細(xì)胞生長調(diào)控的作用引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問題在于提供一種FGFR4高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞，及利用該細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤藥物的篩選，可以作為采用小分子抑制劑阻斷FGFR4表達(dá)來治療腫瘤耐藥性的細(xì)胞模型。?

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：?

一種FGFR4高表達(dá)的重組HEK293細(xì)胞，該重組細(xì)胞是以HEK293細(xì)胞為宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的外源性表達(dá)載體的是包含F(xiàn)GFR4全長基因的表達(dá)載體。?

所述的FGFR4全長基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.l所示。?

所述的包含F(xiàn)GFR4全長基因的表達(dá)載體是pcDNA3.1(+)-FGFR4，該表達(dá)載體是通過BamHI酶切位點(diǎn)將FGFR4全長基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)。?

所述的FGFR4高表達(dá)的HEK293-FGFRl重組細(xì)胞應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選。?

所述的應(yīng)用是將FGFR4高表達(dá)的HEK293-FGFRl重組細(xì)胞構(gòu)建成細(xì)胞膜色譜柱，以保留時(shí)間為指示，篩選以FGFR4為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物。?

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：?