技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酵母展示型脂肪酶協(xié)同超聲波破碎紫菜細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

紫菜含有豐富的多糖和蛋白質(zhì)，可用于制備具有生理活性效應(yīng)的活性多糖和活性多肽。紫菜多糖是多聚半乳糖醛酸硫酸酯，構(gòu)成了紫菜細(xì)胞壁的主要成分。紫菜細(xì)胞內(nèi)含有豐富蛋白質(zhì)，破壞紫菜細(xì)胞壁和細(xì)胞膜后使紫菜細(xì)胞內(nèi)容物流出，可得到紫菜蛋白。因此，要充分地獲得紫菜多糖和紫菜蛋白，應(yīng)當(dāng)盡可能破壞紫菜細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

目前紫菜細(xì)胞破碎主要采用超聲波處理。超聲波處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)可破壞紫菜細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，得到紫菜多糖和紫菜蛋白質(zhì)。但單純用超聲波處理，紫菜細(xì)胞基本保持完整，僅產(chǎn)生少量空隙，從而影響紫菜細(xì)胞破碎效率，不利于紫菜多糖和紫菜蛋白的提取。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種酵母展示型脂肪酶協(xié)同超聲波破碎紫菜細(xì)胞的方法，提高紫菜細(xì)胞破碎率，增加紫菜多糖、紫菜蛋白和紫菜降血壓肽的得率。

一種酵母展示型脂肪酶協(xié)同超聲波破碎紫菜細(xì)胞的方法，包括：

將紫菜干粉、酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，于35～37℃下酶解反應(yīng)30～45min，再于30～32℃下利用功率為730～750W的超聲波破碎65～70min；

所述的酵母展示型脂肪酶通過(guò)如下方法制備：

將線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115中，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72～144h后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗和冷凍干燥制得酵母展示型脂肪酶；

所述的重組質(zhì)粒由原始載體pPIC9K和依次插入原始載體pPIC9K中MFα1信號(hào)肽基因下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。

所述的酵母展示型脂肪酶基因可選用Genbank號(hào)為AF229435的序列，畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115為商業(yè)化產(chǎn)品，可從Invitrogen公司購(gòu)得。它的細(xì)胞壁α凝集素基因序列的Genbank號(hào)為M28164。

載體pPIC9K為商業(yè)化產(chǎn)品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信號(hào)肽序列(Genbank號(hào)：M17301)，同時(shí)該載體內(nèi)信號(hào)肽序列上游存在AOX1啟動(dòng)子(Genbank號(hào)：Z46233)。重組質(zhì)粒線性化處理的目的是為了與胞內(nèi)基因組發(fā)生同源重組，提高表達(dá)穩(wěn)定性。

以重量份計(jì)，水1000份、紫菜干粉20～25份、酵母展示型脂肪酶1～2份。

酶解反應(yīng)同時(shí)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行攪拌，攪拌速率為100～200轉(zhuǎn)/min。

本發(fā)明還提供了一種提取紫菜多糖或紫菜蛋白的方法，包括：

將紫菜干粉、酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，35～37℃下酶解反應(yīng)30～45min，再于30～32℃下利用功率為730～750W的超聲波破碎65～70min，得細(xì)胞破碎液，分離純化得紫菜多糖或紫菜蛋白。

所述紫菜多糖或紫菜蛋白的分離純化方法：將所述細(xì)胞破碎液離心后取上清液，鹽析，4℃靜置12h后離心，上清液為紫菜多糖溶液，沉淀為紫菜蛋白。

本發(fā)明又提供了一種制備紫菜降血壓肽的方法，包括：

將紫菜干粉、酵母展示型脂肪酶加入水中混勻，于35～37℃下酶解反應(yīng)30～45min，再于30～32℃下利用功率為730～750W的超聲波破碎65～70min，分離純化得到紫菜蛋白；將紫菜蛋白、酵母展示型蛋白酶加入水中混勻，于36～37℃下酶解反應(yīng)130～133min，得紫菜降血壓肽；

所述的酵母展示型蛋白酶通過(guò)如下方法制備：

將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115中，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72～144h后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗和冷凍干燥制得酵母展示型蛋白酶；

所述重組質(zhì)粒由原始載體pPIC9K和依次插入原始載體pPIC9K中MFα1信號(hào)肽基因下游的蛋白酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。

所述的酵母展示型蛋白酶基因可選用Genbank號(hào)為NM_012708.2的序列。

以重量份計(jì)，水1000份、紫菜蛋白20～22份、酵母展示型蛋白酶1～1.1份。