技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因敲除載體及沙門菌減毒疫苗，尤其涉及一種沙門菌yncD基因敲除載體及其制備方法及敲除沙門菌中的yncD基因制備的沙門菌減毒疫苗。

背景技術(shù)

沙門菌屬細(xì)菌包括2500多個(gè)血清型，其中部分血清型(傷寒沙門菌、甲型、乙型和丙型副傷寒沙門菌)可以引起人類的傳染病，即腸熱癥(傷寒或副傷寒)；另外部分沙門菌是人畜共患病的病原體，可引起人類食物中毒或者敗血癥(如鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌等)。沙門菌引起的疾病發(fā)病率高，危害嚴(yán)重，例如作為腸道傳染病的傷寒和副傷寒，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年有1600-3300萬感染者，死亡病例在50-60萬左右。傷寒病例長期位居我國法定傳染病的前10位，各地每年仍有大量散發(fā)病例，還時(shí)有局部的爆發(fā)流行，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。而由沙門菌引起的食物中毒則更為常見，是我國細(xì)菌性食物中毒的最常見病原之一。因此對(duì)于沙門菌感染的控制是一件非常重要的課題。對(duì)于沙門菌感染的控制需要采取綜合措施，包括改善衛(wèi)生條件以及有效疫苗的使用。通過疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)沙門菌的特異性免疫反應(yīng)是一種有效的低成本預(yù)防策略。

接種疫苗的基本目的是誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)病原體的感染起到免疫保護(hù)的作用。這一目的可以通過減毒活疫苗株的接種而實(shí)現(xiàn)，減毒疫苗株是對(duì)病原體進(jìn)行一定方式的處理，使其毒力減弱到不至于引起宿主感染，但同時(shí)又可以有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的活疫苗株。傳統(tǒng)上的減毒株構(gòu)建方法是對(duì)病原體反復(fù)傳代，或者采用化學(xué)誘變劑處理而獲得。但這兩種方式獲得的減毒株，往往減毒機(jī)制不清楚，因?yàn)檫z傳背景不清楚(可能發(fā)生單一突變，也可能發(fā)生多個(gè)突變，而這些突變不都和毒力減弱有關(guān))。因此，對(duì)其回復(fù)突變可能性的評(píng)價(jià)也存在困難。由于多重突變可能的存在，也很難拿到一個(gè)免疫效果良好的減毒株(因?yàn)楹芸赡茉谡T變過程中，一個(gè)編碼保護(hù)性抗原的基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致免疫原性下降)。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得可以通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建遺傳背景清楚的減毒疫苗株。這種方式往往需要對(duì)影響細(xì)菌生長的某些重要基因或者與細(xì)菌致病性有關(guān)的毒力基因進(jìn)行敲除操作。到目前為止，采取這種方式，已經(jīng)針對(duì)沙門菌構(gòu)建了很多的減毒株，涉及的基因包括aro，pur，htrA，ompR，ompF，ompC，galE，cya，crp和phoP等的不同組合。

然而，減毒株的構(gòu)建必須把握一個(gè)平衡，即首先要將病原體的毒力減弱，使其接種宿主后不會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生；但同時(shí)其毒力減弱的程度又不能過大，還需保證其能在機(jī)體內(nèi)短暫生存，以有效誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)。為取得這樣一個(gè)平衡，就需要對(duì)不同組合的靶基因進(jìn)行敲除，然后測(cè)試其毒力和安全性，以獲得符合臨床應(yīng)用要求的減毒株。

因此對(duì)于病原體新型減毒疫苗的研制來說，通過研究不斷發(fā)現(xiàn)新的可以實(shí)現(xiàn)減毒的靶基因，并采用適宜方法將其突變是一個(gè)基本前提。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種敲除沙門菌中的yncD基因制備而成的沙門菌減毒疫苗，其可通過應(yīng)用上述的沙門菌yncD基因敲除載體敲除沙門菌中的yncD基因制備。所述疫苗使用方便，安全性高。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種沙門菌yncD基因敲除載體，所述載體能夠準(zhǔn)確敲除沙門菌種yncD基因，敲除株的毒力發(fā)生顯著性降低，而且毒力不發(fā)生回復(fù)。該沙門菌yncD基因敲除載體制備簡單、使用安全有效。

本發(fā)明所述的沙門菌減毒疫苗，是將yncD基因敲除而實(shí)現(xiàn)減毒的沙門菌減毒疫苗。

所述疫苗是通過沙門菌yncD基因敲除載體敲除yncD基因。

所述沙門菌yncD基因敲除載體包含pYG4質(zhì)粒序列和中間去掉yncD基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的yncD基因上下游序列。

所述中間去掉yncD基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的yncD基因上下游序列如SEQ?ID?NO：2所示。

所述pYG4質(zhì)粒序列如SEQ?ID?NO：1所示。

所述沙門菌為傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、豬霍亂沙門菌和鼠傷寒沙門菌中的至少一種。

沙門菌yncD基因敲除載體，其包含pYG4質(zhì)粒序列和中間去掉yncD基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的yncD基因上下游序列。

所述pYG4質(zhì)粒序列如SEQ?ID?NO：1所示，所述中間去掉yncD基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的yncD基因上下游序列如SEQ?ID?NO：2所示。

沙門菌減毒疫苗制備方法有以下步驟：

1)通過PCR方式獲得拼接在一起的中間去掉yncD基因序列同時(shí)保證閱讀框不發(fā)生變化的yncD基因上下游序列；