本申請系200510030397.X(申請日2005年10月11日)的分案申請。

技術領域

本發明涉及酶學、含有酶的組合物及分離或純化方法技術領域，具體涉及一種羧肽酶B的制備方法及其組合物。

背景技術

羧肽酶B(carboxypeptidase?B，簡稱CPB，EC3.4.17.2)是一種含鋅的胰外肽酶，特異性水解肽鏈C末端的堿性氨基酸：精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。羧肽酶B含307個氨基酸殘基，分子量35KDa。豬胰臟中存在的羧肽酶B是由前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase?B)產生的。前羧肽酶原B的N末端包含108個氨基酸的片斷(其中13個氨基酸為信號肽序列、95個氨基酸殘基組成活性肽部分)與C末端的羧肽酶B相連，前羧肽酶原B在轉運到內質網的過程中，信號肽被剪切得到不具有活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase?B)從細胞中分泌出來，然后通過胰蛋白酶酶解為具有活性的羧肽酶B和活性肽部分。

羧肽酶B廣泛用于蛋白質及肽類C末端氨基酸測序，或用于蛋白質或多肽的C末端堿性氨基酸殘基的修飾。在醫學上用于診斷胰腺炎。目前在基因工程領域獲得了越來越廣泛的應用，特別在重組人胰島素的生產過程中，羧肽酶B為不可或缺的雙酶之一，其比活性的高低及穩定性是影響胰島素原活化收率的一個重要參數〖周穎、楊樺、肖尚志、喬德水，羧肽酶B的穩定性考察，中國生化藥物雜志，2002，23(4)：185-186〗。

現有的從動物胰臟提取羧肽酶B的生產方法是動物胰臟勻漿激活、分級鹽析、透析、離子交換層析，再鹽析、透析，最后加鹽凍存，其中鹽析和透析周期長，效率低；而且離子交換層析通常經過三步，回收率大為降低。文獻報道了采用勻漿、硫酸銨鹽析的方法進行初步提取，然后采用疏水層析、離子交換層析的方法進行純化，顯著提高了羧肽酶B的活力及得率〖王偉剛、曹雪梅、溫傳彬、戴素霞、楊樺、孔毅，從豬胰臟中提取及純化羧肽酶B工藝改進，武漢工業學院學報，2002，(2)：P16-17、21〗。但是該方法由于是在勻漿后進行鹽析操作，勻漿液中存在的脂類不利于后續的抽提操作，羧肽酶B的得率較低，而且鹽析后活性羧肽酶B存在于清液中不利于長期保存，必須立即進行后續單元操作。

現有技術中羧肽酶B在離子交換層析后，加鹽濃縮凍存，其穩定性差，保存時間僅為2月。

發明內容

為了克服羧肽酶B制備方法的現有技術中存在的缺陷，發明人進行了廣泛而深入的研究。發明人比較了多種羧肽酶B的抽提方法及其純化工藝，通過使用丙酮破碎胰臟、制備丙酮粉的方法成功解決了上述技術缺陷，發明人對丙酮抽提方法進行了廣泛研究。

為了克服現有技術中羧肽酶B制劑不穩定的缺陷，發明人進行了廣泛研究。

基于上述研究，本發明所要解決的技術問題之一是提供一種羧肽酶B的制備方法，以克服現有技術中存在的羧肽酶B得率低的技術缺陷。

本發明所要解決的技術問題之二是提供一種穩定的羧肽酶B組合物以克服現有技術中羧肽酶B穩定性差的技術缺陷。

為解決上述羧肽酶B制備方法中存在的技術問題，發明人采取的技術方案是：用丙酮抽提胰臟羧肽酶B，制備包含羧肽酶B的丙酮粉。然后采用疏水層析、離子交換層析純化羧肽酶B，本發明的技術路線如圖1。

其中，丙酮粉的制備方法是：將胰臟用1～5倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉。胰臟是新鮮的胰臟或者凍胰臟，胰臟用機械方法粉碎。優選地，選用凍胰臟用機械方法粉碎后，加1～5倍量預冷的丙酮處理2～3次。更優選地，凍胰臟機械粉碎后自溶16～24hr，加1～5倍量預冷的丙酮處理2～3次。每次用丙酮處理后收集濾渣，收集濾渣的方法在本領域是已知的，例如離心收集濾渣或者過濾收集濾渣。最后收集的濾渣干燥后即得丙酮粉。濾渣干燥的方法在本領域是已知的，如自然風干等。

優選地，制備包含羧肽酶B的丙酮粉的方法是：將凍胰臟機械粉碎，用1～5倍量的預冷丙酮處理2～3次，收集最后濾渣后用1～5倍量丙酮/乙醚混合液(體積比1∶1)處理，收集濾渣干燥后獲得丙酮粉。更優選地，上述濾渣再用1～5倍量乙醚處理，收集濾渣干燥獲得丙酮粉。

上述所說的“1～5倍量”的含義是每g胰臟1～5ml丙酮或其它溶液，在下文中如沒有特別說明，凡提到“倍量”均為該含義。