技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種采用標(biāo)記探針進行核酸檢測和熔解曲線分析的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及采用雙標(biāo)記寡核苷酸探針對含有至少一個突變核苷酸的靶核酸序列進行分析的方法。

背景技術(shù)

Real-time?PCR可以用來檢測和定量靶核酸序列。如今許多以探針為基礎(chǔ)的方法應(yīng)用于real-time?PCR中，例如TaqMan探針(U.S.Pat.Nos.5,210,015?and?5,487,972)，分子信標(biāo)探針(molecularbeacons，U.S.Pat.Nos.5,925,517?and?6,103,476)，自我檢測擴增子(self-probing?amplicons)，也稱scorpions(U.S.Pat.No.6,326,145)，Amplifluor(Chen?et?al.，Appl.Environ.Microbiol.64：4210-6，1998)，Amplifluor(U.S.Pat.No.6,117,635)，置換雜交探針(Li?et?al.，Nucleic?Acids?Res.30：E5，2002)，DzyNA-PCR(Todd?et?al.，Clin.Chem.46：625-30，2000)，熒光限制性內(nèi)切酶檢測(Cairns?et?al.Biochem.Biophys.Res.Commun.318：684-90，2004)，相鄰雜交探針(U.S.Pat.No.6,174,670和Wittwer?et?al.，Biotechniques?22：130-1，134-8，1997)等。總而言之，熒光標(biāo)記的探針提高了靶序列定量的特異性。

關(guān)于基因型多態(tài)性和稀有突變的檢測已經(jīng)申請了很多專利。突變的檢測對于病理性突變的早期診斷是非常重要的，尤其是對于癌癥和耐藥的突變檢測更為重要。近年來報到了很多檢測突變的方法，期間基于real-time?PCR技術(shù)鑒別等位基因的方法也得到了發(fā)展，兩種主要的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。其中一種主要技術(shù)為，熒光信號是在每個PCR循環(huán)的結(jié)束時通過探針的雜交或水解產(chǎn)生的，例如TaqMan探針和分子信標(biāo)探針技術(shù)。熒光檢測一定是在PCR過程中或結(jié)束時。這些技術(shù)由于等位基因的特異性而需要使用兩條探針，其中一條探針對應(yīng)第一個等位基因，另外一條探針對應(yīng)第二個等位基因。另外一種主要技術(shù)為，通過熔解曲線分析來檢測突變，同樣通常需要兩條探針進行熔解曲線分析，例如鄰近雜交探針。近年來，出現(xiàn)了一種單標(biāo)記探針(U.S.Pat.No.6,635,427)。較高的熒光背景和對序列特異核苷酸的依賴讓單標(biāo)記探針具有一定的局限性。基于雙標(biāo)記TaqMan探針的熔解曲線分析方法也有報道(Housni?et?al.，2003)。然而，這個報道中的標(biāo)記TaqMan探針的檢測方法也有其局限性。首先，它使用了具有5’核酸酶活性的Taq聚合酶，為了防止發(fā)生常規(guī)TaqManreal-time?PCR延伸步驟中探針的水解，所選探針的熔解溫度(Tm值)要比PCR引物的Tm值低10℃，由于探針的Tm值較低，因此探針的雜交效率也較低，而造成最終的熒光檢測信號也比較弱，探針的Tm值較低也就意味著探針較短，這就使得探針沒有辦法覆蓋到靶序列較長的距離，這對于檢測一個基因核心區(qū)域的一連串突變是很不利的，例如TB耐藥中RpoB基因的核心區(qū)域；其次，以TaqMan探針為基礎(chǔ)的熔解曲線分析一般不適用于長探針，由于報告標(biāo)記和猝滅標(biāo)記被長距離的核苷酸所隔離，而使報告標(biāo)記和猝滅標(biāo)記無法相互作用。對于一個長的TaqMan探針，很難檢測到探針雜交狀態(tài)和處于單鏈狀態(tài)時熒光強度的差異。在現(xiàn)有的技術(shù)方法中，TaqMan?real-time?PCR方法可以在每個循環(huán)實時檢測熒光信號，但通常不能進行熔解曲線分析。Housni等報道的改進后的基于TaqMan的方法，當(dāng)探針遇到合適的條件時能夠進行熔解曲線分析，但不能在每個循環(huán)實時檢測熒光信號。基于分子信探針的方法可以在每個循環(huán)實時檢測熒光信號，但不能對探針與靶序列雜交的混合物進行熔解曲線分析。鄰近雜交探針可以進行實時檢測和熔解曲線分析，但同時需要兩條探針，一條探針用于錨定，另外一條探針用于報告。

這就需要一種改進的探針用于實時監(jiān)測PCR反應(yīng)和/或進行熔解曲線分析，同時也需要一種可以覆蓋包含多個突變位點的靶序列較大區(qū)域的探針。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用標(biāo)記探針進行檢測和熔解曲線分析的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

首先，提供一種從樣本中檢測靶核酸序列的方法，包括：