技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種重組惡臭假單胞菌及其構建方法和應用，利用該重組惡臭假單胞菌可以去除生活污水中的磷。

背景技術

無機磷酸鹽通常被認為是湖泊富營養化的關鍵因子。因而，降低水環境中磷的濃度是控制富營養化的重要手段之一。

環境中磷的去除有物理、化學以及生物法。生物尤其是微生物，去除磷的機理在于包括Escherichia?coli，Pseudomonas?spp.等細菌均具有積累無機磷酸鹽，生成多聚磷酸鹽(poly-phosphate)的能力。但是，在天然條件下，微生物聚磷能力通常比較弱，或者需要厭氧好氧交替環境才能有效聚磷。

多聚磷酸鹽由聚磷激酶(Poly-phosphate?Kinase，PPK)催化形成。是由3～1000多個不等的正磷酸鹽通過高能磷酸鍵連接而成的線性多聚體。聚磷通常被認為是能量儲存的一種手段，同時具有多種生理功能。有學者通過轉基因手段，將聚磷酸激酶基因ppk轉化到各種質粒中，過量表達聚磷激酶。攜帶重組有ppk基因質粒的微生物或植物能夠過量的吸收環境中磷酸鹽形成大量聚磷。從而用于廢水中磷的去除或者利用聚磷的絡合能力降低環境中重金屬毒性，增加重金屬的生物有效性，增加植物對重金屬的耐受性，提高植物對重金屬的去除能力等。通過重組質粒表達ppk基因，雖然能夠過量的表達聚磷激酶，但是，質粒表達的缺點同樣明顯，重組質粒容易丟失。只有在抗生素脅迫下才能夠相對穩定存在，由此引發實際應用成本的增加。并且高拷貝質粒對菌的生命活動造成負擔。因而質粒作為載體表達ppk基因有很大的局限。另外，當前用于廢水中去除磷的研究中所用表達宿主全部為E.coli。E.coli直接用于廢水或自然水體磷的去除是不切實際的。

整合表達一定程度上解決了質粒表達的遺傳不穩定的問題，同時選擇環境中以及廢水處理的活性污泥中的優勢種惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)作為宿主，可以用于實際的廢水處理。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種具有較高遺傳穩定性的重組惡臭假單胞菌，能夠高效去除廢水中的磷。

本發明還要解決的技術問題是提供上述重組惡臭假單胞菌的構建方法。

本發明最后要解決的技術問題是提供上述重組惡臭假單胞菌在廢水除磷中的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種重組惡臭假單胞菌，它是DNA整合表達聚磷激酶ppk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)。

上述重組惡臭假單胞菌的構建方法，它包括ppk基因的獲取、載體的構建、三親接合三大步驟，具體步驟如下：

(1)ppk基因的獲取：

(1a)提取E.coli?DH5α總DNA，具體方法參見《環境微生物實驗技術》(北京：中國環境科學出版社，2004.71-72)。

(1b)根據大腸桿菌的基因序列(Genbank登錄號：L03719)設計引物，并在引物5’端加入EcoR?V酶切位點，以總DNA為模板，PCR擴增ppk基因。

(2)載體的構建：

(2a)將步驟(1b)得到的PCR產物插入到質粒pBBR1MCS-2中，獲得重組質粒pBBR1MCS-2-ppk；具體為將質粒pBBR1MCS-2以及步驟(1b)得到的PCR產物經EcoRV酶切，質粒pBBR1MCS-2進行去磷酸化反應，PCR產物經磷酸化反應，在5’端加磷，然后將上述處理的PCR產物和質粒酶連反應過夜，即獲得重組質粒pBBR1MCS-2-ppk。

(2b)將步驟(2a)得到的重組質粒pBBR1MCS-2-ppk轉化E.coli?DH5α進行復制。

(2c)提取重組質粒pBBR1MCS-2-ppk，作為模板，設計含有NoT?I酶切位點的引物，PCR擴增含有多克隆位點上游多重啟動子序列和多克隆位點下游終止子序列的片段；

(2d)將步驟(2c)得到的PCR產物經Not?I酶切后插入到自殺質粒pUTmini-Tn5中，得到重組質粒pUTmini-Tn5-ppk。

(3)三親接合：

(3a)將步驟(2d)得到的重組質粒pUTmini-Tn5-ppk經電擊轉化到供體菌E.coliSM10(λpir)(電擊轉化及感受態細胞的制備參見《分子克隆指南》【3^rd，北京：科學出版社.2002.】)。