[發(fā)明專利]一種重組惡臭假單胞菌及其構建方法和應用無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201010163000.5 | 申請日： | 2010-05-05 |
| 公開（公告）號： | CN101899413A | 公開（公告）日： | 2010-12-01 |
| 發(fā)明（設計）人： | 武俊;杜宏偉;楊柳燕;肖琳;李麗觀;呂志剛;陳洪齡;凌小君;張全興 | 申請（專利權）人： | 南京大學;江蘇江達生態(tài)科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/54;C12N15/63;C02F1/58;C02F3/34;C12R1/40;C02F101/10 |
| 代理公司： | 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 肖明芳 |
| 地址： | 210008*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 重組 惡臭 假單胞菌 及其 構建 方法 應用 | ||
1.一種重組惡臭假單胞菌，其特征在于它是DNA整合表達聚磷激酶ppk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)。
2.權利要求1所述的重組惡臭假單胞菌的構建方法，其特征在于它包括如下步驟：
(1)ppk基因的獲取：
(1a)提取E.coli?DH5α總DNA；
(1b)根據(jù)大腸桿菌的基因序列設計引物，以總DNA為模板，PCR擴增ppk基因；
(2)載體的構建：
(2a)將步驟(1b)得到的PCR產(chǎn)物插入到質粒pBBR1MCS-2中，獲得重組質粒pBBR1MCS-2-ppk；
(2b)將步驟(2a)得到的重組質粒pBBR1MCS-2-ppk轉化E.coli?DH5α進行復制；
(2c)提取重組質粒pBBR1MCS-2-ppk，作為模板，設計引物，PCR擴增含有多克隆位點上游多重啟動子序列和多克隆位點下游終止子序列的片段；
(2d)將步驟(2c)得到的PCR產(chǎn)物插入到自殺質粒pUTmini-Tn5中，得到重組質粒pUTmini-Tn5-ppk；
(3)三親接合：
(3a)將步驟(2d)得到的重組質粒pUTmini-Tn5-ppk經(jīng)電擊轉化到供體菌E.coliSM10(λpir)；
(3b)將受體菌Pseudomonas?putida?KT2440、步驟(3a)得到的含重組質粒的供體菌E.coli?SM10(λpir)/pUTmini-Tn5-ppk、輔助菌E.coli?DH5α(pRK600)，分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，在受體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為25μg/mL的氯霉素，在供體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為10μg/mL的卡那霉素和25μg/mL的氯霉素，在輔助菌培養(yǎng)基中加入終濃度為10μg/mL的卡那霉素和25μg/mL的氯霉素；
(3c)將步驟(3b)培養(yǎng)后的受體菌、供體菌和輔助菌按照1∶2∶2的體積比三親接合，獲得重組惡臭假單胞菌KT2440-PPK。
3.權利要求1所述的重組惡臭假單胞菌在廢水除磷中的應用。
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