技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組多主枝孢霉變應(yīng)原Cla?h8蛋白的制備方法及其用途

背景技術(shù)

過敏性哮喘是危害嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率及死亡率呈持續(xù)上升趨勢。據(jù)WHO估計，全世界現(xiàn)有3億的哮喘患者，其中50％以上的成人和至少80％的兒童患者均由過敏因素誘發(fā)，每年有25萬以上的患者死于哮喘，哮喘已不僅是發(fā)達(dá)國家的公共衛(wèi)生問題，幾乎所有國家都深受其害。統(tǒng)計報道，我國大陸哮喘的發(fā)病率尚較低，為2.1％(不包括香港6.2％和臺灣2.6％)，但我國哮喘患者的死亡率卻高達(dá)36.7/10萬，位居全球第一。此外，我國哮喘的發(fā)病在各地區(qū)之間的差異可達(dá)10倍，以重慶最高，西藏最低，并且在未來十年內(nèi)，哮喘的發(fā)病將持續(xù)上升，由于我國人口基數(shù)大，哮喘的發(fā)病率上升2個百分點，將增加2千萬以上的發(fā)病人數(shù)。

研究顯示，過敏性哮喘可以由多種因素誘發(fā)，其中環(huán)境中存在的各種變應(yīng)原是其主要誘發(fā)原因。這些變應(yīng)原包括塵螨、動物的皮屑、花粉和霉菌等。在溫濕環(huán)境中，霉菌是引起過敏性疾病的主要誘因。據(jù)報道，在美國的南部，30％的過敏患者對多種霉菌敏感。多主枝孢霉(Cladosporium?herbarum)就是一種主要引起過敏性疾病的霉菌，它不僅是一種主要的室內(nèi)過敏原，也是夏秋兩季的主要室外過敏原。

多主枝孢霉含有多種變應(yīng)原蛋白，其中Cla?h8變應(yīng)原蛋白是其主要變應(yīng)原蛋白。57％以上多主枝孢霉過敏患者血清中的IgE抗體可以特異性的識別Cla?h8變應(yīng)原蛋白。皮膚點刺實驗結(jié)果顯示Cla?h8可以引起患者出現(xiàn)皮膚的紅腫。

目前臨床上對多主枝孢霉過敏患者的診斷和特異性抗原免疫治療采用的是傳統(tǒng)的多主枝孢霉浸出液，其含有多種抗原成分，且相對效價和特異性抗原水平存在明顯的差異，很難進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量，容易引起患者出現(xiàn)診斷或治療性過敏反應(yīng)，因此限制了對其診治應(yīng)用。而重組的多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白不僅產(chǎn)量高，生產(chǎn)條件恒定，有利于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，更適合進(jìn)行臨床診斷與治療。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對多主枝孢霉變應(yīng)原浸出液進(jìn)行過敏性疾病的診斷與治療中的不足，提供一種重組多主枝孢霉變應(yīng)原Cla?h8蛋白的制備方法及其用途。

本發(fā)明通過基因工程手段，從多主枝孢霉的組織中提取其主要變應(yīng)原蛋白Cla?h8的編碼基因，構(gòu)建表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)重組多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白Cla?h8，本發(fā)明制得的重組多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白Cla?h8可用于多主枝孢霉引起的過敏性疾病的診斷與治療。

具體而言，本發(fā)明提供了重組多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白Cla?h8的表達(dá)方法，其特征在于，其包括如下步驟：

(1)從培養(yǎng)的多主枝孢霉菌體中提取總RNA，通過RT-PCR合成cDNA；

(2)合成引物：

Cla?h8-S?5-CCCATATGCCTGGCCAGCAAGCAA-3

Cla?h8-as?5-CGGGATCCTTATCTGGTGGTGTAACCA-3

(3)以cDNA為模板，通過PCR獲得多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白Cla?h8編碼基因片段；所述的Cla?h8編碼基因如SEQ?ID?No：1所示，其所編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No：2所示；

(4)將編碼基因克隆入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主菌，培養(yǎng)所得重組工程菌，然后誘導(dǎo)其表達(dá)目的蛋白；

(5)采用緩沖液對rCla?h8包涵體進(jìn)行洗滌，將其提純后，采用谷胱甘肽還原系統(tǒng)對其復(fù)性，從而獲得重組多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白Cla?h8；

(6)免疫學(xué)方法鑒定重組多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白Cla?h8免疫原性。

本發(fā)明中，所述的表達(dá)載體不限于特定的表達(dá)載體，只要它能夠與所述cDNA基因重組，形成適宜表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明優(yōu)選表達(dá)載體為原核表達(dá)載體；本發(fā)明更優(yōu)選原核表達(dá)載體為pET19b。

本發(fā)明中，所述的宿主細(xì)胞不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體。本發(fā)明優(yōu)選宿主菌為大腸桿菌BL21Star^TM(DE3)pLysS，培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為20～37℃，培養(yǎng)時間6～16小時。

本發(fā)明中，步驟(5)所述誘導(dǎo)劑為IPTG。培養(yǎng)的菌體達(dá)到合適的濃度后以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度為0.1～1mM，誘導(dǎo)溫度為20～37℃，誘導(dǎo)時間為2～16小時。