[發明專利]一種重組多主枝孢霉變應原Cla h8蛋白的制備方法及其用途無效
| 申請號: | 201010141209.1 | 申請日: | 2010-04-02 |
| 公開(公告)號: | CN102212531A | 公開(公告)日: | 2011-10-12 |
| 發明(設計)人: | 付永鋒;程訓佳;馮萌 | 申請(專利權)人: | 復旦大學 |
| 主分類號: | C12N15/31 | 分類號: | C12N15/31;C12N15/63;C07K14/37;A61K38/16;A61P37/08;G01N33/53 |
| 代理公司: | 上海正旦專利代理有限公司 31200 | 代理人: | 吳桂琴 |
| 地址: | 20043*** | 國省代碼: | 上海;31 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 重組 主枝 霉變 cla h8 蛋白 制備 方法 及其 用途 | ||
1.一種重組多主枝孢霉變應原蛋白Cla?h8的制備方法,其特征在于,其包括如下步驟:
1)從培養的多主枝孢霉菌體中提取總RNA,通過RT-PCR合成cDNA;
2)合成引物:
Cla?h8-S?5-CCCATATGCCTGGCCAGCAAGCAA-3
Cla?h8-as?5-CGGGATCCTTATCTGGTGGTGTAACCA-3
3)以cDNA為模板,通過PCR獲得多主枝孢霉變應原蛋白Cla?h8編碼基因片段;
4)將編碼基因克隆入表達載體中,轉化宿主菌,培養所得重組工程菌,然后誘導其表達目的蛋白;
5)采用緩沖液對rCla?h8包涵體進行洗滌,將其提純后,采用谷胱甘肽還原系統對其復性,獲得重組多主枝孢霉變應原蛋白Cla?h8;
6)免疫學方法鑒定重組多主枝孢霉變應原蛋白Cla?h8免疫原性。
2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟3)中,Cla?h8編碼基因如SEQID?No:1所示;所編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No:2所示。
3.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟4)的表達載體不限于特定的表達載體,只要它能夠與所述cDNA基因重組,形成適宜表達質粒。
4.根據權利要求1或3所述的方法,其特征在于,所述的表達載體為原核表達載體。
5.根據權利要求1或3所述的方法,其特征在于,所述的表達載體為pET19b。
6.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟4)的宿主菌不局限于任何特定的宿主細胞,只要它能夠表達所述重組表達載體。
7.根據權利要求6所述的方法,其中所述的宿主細胞為大腸桿菌BL21?StarTM(DE3)pLysS。
8.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟4)中,宿主菌的培養基是LB液體培養基,培養溫度是20~37℃,培養時間6~16小時。
9.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟4)中,菌體達到合適的濃度后用IPTG誘導表達,誘導條件為:IPTG濃度為0.1~1mM,誘導溫度為20~37℃,誘導時間為2~16小時。
10.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟5)中的純化方法為:將多主枝孢霉變應原蛋白Cla?h8表達工程菌在37℃誘導3小時后,離心收集菌體,置于冰上超聲裂解,然后加入溶菌酶30℃振搖30分鐘,離心,收集包涵體蛋白沉淀,以Novagen公司的refolding?kit對包涵體蛋白進行提純與復性后,14000rmp離心20分鐘,收集上清,冰箱保存。
11.權利要求1的方法制得的重組多主枝孢霉變應原蛋白Cla?h8在制備診斷與治療多主枝孢霉引起的過敏性疾病制劑中的用途。
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