技術領域

本發明涉及一種快速檢測食品質量的方法，具體的說，涉及一種快速檢測產腸毒素大腸桿菌的試劑盒及檢測方法。

背景技術

食品安全突發事件頻率高是近年來社會公共安全問題的一個顯著特點。在食品污染所引發的腸道疾病中，產腸毒素大腸桿菌是引起食物中毒的常見腸道致病菌之一。有效控制食品污染擴散，對食品質量的監督和檢測提出了更高的要求。如何快速、準確的檢測食品中的病原菌，是控制食品安全事故發生的基礎。

目前，國內檢測產腸毒素大腸桿菌仍采用傳統的方法，其操作繁瑣，檢測時間長，通常需要3～5天。

環介導等溫擴增(loop-mediated?isothermal?amplification，簡稱LAMP)是利用4個特殊設計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA的新技術。該技術在1h內能擴增出10⁹靶序列拷貝，擴增產物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環結構和多環花椰菜樣結構的DNA片段的混合物，電泳后在凝膠上顯現出由不同大小的區帶組成的階梯式圖譜。LAMP技術以其特異性強、靈敏度高、快速、準確和操作簡便等優點在核酸的科學研究、疾病的診斷和轉基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。

本發明采用環媒恒溫基因擴增技術，建立了快速檢測不耐熱型產腸毒素大腸桿菌的方法，縮短了檢測時間(2-3小時完成)，提高了檢測的靈敏性，為快速、準確檢測食品是否發生病原菌污染，預防食品安全事故發生提供了可能。

發明內容

本發明提供一種檢測產腸毒素大腸桿菌的試劑盒，其含有引物

SEQ?ID?NO：1??attacatttaagagcggcgc；

SEQ?ID?NO：2??ggttcctagcattagacatgcttt；

SEQ?ID?NO：3??gtgtatggaataataaaacccctaaagcaaactagttttcca；

SEQ?ID?NO：4??gtgtccttcatcctttcaatggcaggtcgaagtcccgggcagtc

特異性擴增來自產腸毒素大腸桿菌的基因。

所述產腸毒素大腸桿菌的基因為編碼不耐熱腸毒素的基因，其基因序列如SEQ?ID?NO：5所示。

進一步的，所述試劑盒還含有Mg²⁺，更進一步的，所述試劑盒還含有顯色劑。

優選的，所述顯色劑是綠色核酸凝膠染液(SYBR?Green?I)鉬酸銨或硫酸銅。

本發明的另一目的是提供一種快速檢測食品是否被產腸毒素大腸桿菌污染的方法，包括以下步驟：

1)提取待檢樣本中的DNA；

2)用引物對樣本中的DNA進行擴增，所述引物如SEQ?ID?NO：1～4所示；

3)對DNA擴增結果進行檢測。

其中，步驟2)的擴增條件為，dNTPs濃度為0.6mM，Bst酶添加量為8U，擴增溫度為55-65℃，擴增反應最短反應時間為40min。

步驟3)所述的檢測DNA擴增結果的方法是：觀察是否生成焦磷酸鎂沉淀或沉淀顯色。

根據本發明的另一方面，還提供如SEQ?ID?NO：1～4所示寡核苷酸序列的用途，其用于擴增或檢測來自病原體產腸毒素大腸桿菌的基因。

本發明依據不耐熱腸毒素(LT)編碼基因的6個保守區，采用引物設計軟件設計LAMP引物，優化了dNTPs濃度、BstDNA聚合酶濃度、反應溫度、反應時間等反應條件，結果理想，并對該方法進行了特異性、敏感性試驗，初步探索了可實際應用的試劑盒條件。

產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic?E.coli，ETEC)的核苷酸序列總長度約為70kb，主要有兩類致病基因：一類為菌毛蛋白基因(或稱粘著素、定居因子)，已知的粘著素有K₈₈，K₉₉，987P，CFA，PCF0166，F41等。另一類為腸毒素基因，ETEC的主要毒力因子為耐熱性腸毒素(heat-stable?enterotoxin，ST)和不耐熱性腸毒素(heat-labile?enterotoxin，LT)，ST和LT是導致幼齡動物腹瀉的直接致病因子。ETEC借助這些粘著素定居于宿主腸道粘膜的上皮細胞上，從而大量繁殖，產生大量腸毒素。