技術領域

本發明涉及一種谷胱甘肽硫轉移酶基因型檢測方法，用于檢測谷胱甘肽硫轉移酶類家族MU類(GSTM1基因)缺失、THETA類(GSTT1基因)缺失和PI類(GSTP1)的變異，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

外源性化學物質包括治療性藥物、環境或職業密切接觸的物質等。機體對外來化合物的代謝過程包括I相反應和II相反應，I相反應主要對外來化合物進行生物轉化，如：氧化、還原、水解反應。II相反應則對I相反應代謝活化后所產生的中間代謝產物與體內的化合物進行結合反應，如：谷胱甘肽結合、葡糖醛酸化等反應。一般講外來化合物經機體代謝后毒性降低或喪失，但亦有少數外來化合物經機體代謝后毒性增高，對人體產生危害。

谷胱甘肽硫轉移酶類家族GST在機體內行使功能和參與反應的途徑是參與谷胱甘肽代謝通路。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構成的三肽物質，并帶有活性的巰基，主要存在于細胞液內，在機體和細胞內行使多種生化作用，具有重要的意義。谷胱甘肽的一個主要作用，是通過谷胱甘肽硫轉移酶類家族的作用，使谷胱甘肽的半胱氨酸殘基上具有很強親核力的巰基基團，去與親電子的靶物質結合。通過谷胱甘肽和化學物質或其代謝反應產物結合，可以降低這些物質的毒性，從而使細胞免受損害。

谷胱甘肽所結合的親電子物質包括很多種，如致癌物質、藥物、環境毒素、氧化鏈產物等等。常見的藥物結合底物包括：水楊酸鹽、撲熱息痛、抗癆藥、利尿酸、苯巴比妥、有機磷農藥、抗腫瘤藥物等。當谷胱甘肽與多種氧化鏈代謝產物反應后，產生的減毒結合物可使其易于進入下一步代謝，并最后以硫醇尿酸的形式排泄出體外。

大樣本量中國人群研究證實，谷胱甘肽硫轉移酶類家族MU類(GSTM1基因)缺失、THETA類(GSTT1基因)缺失和PI類(GSTP1)變異在中國人群眾普遍存在(GSTM1缺失64％、GSTT1缺失55％、GSTP1?Ile105Val變異29％)與谷胱甘肽硫轉移酶活性以及多種毒物、藥物的代謝顯著相關。以往的檢測方法在對GSTM1和GSTT1的大片段缺失進行檢測時出現的假陽性現象無法很好的排查和解釋，本發明中增加了一對內參因物的設計避免了這一現象，同時適用于大樣本量的谷胱甘肽硫轉移酶基因分型檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種準確率高的谷胱甘肽硫轉移酶基因型檢測方法。

為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供一種谷胱甘肽硫轉移酶基因型檢測方法，其特征在于，具體步驟為：

步驟1.檢測的樣品類型與采樣方法：

用采樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細胞樣本；

步驟2.基因組DNA的抽提方法：

采用硅膠吸附法抽提每一個被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一2.5小時，經電泳檢測后，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；

步驟3.基因分型：

采用PCR技術、凝膠電泳技術以及熒光定量PCR技術對谷胱甘肽硫轉移酶類家族MU類GSTM1基因、THETA類GSTT1基因和PI類GSTP1基因位點進行分型：

步驟3-1，PCR反應體系：

將每一個被測者樣本放入1個反應孔，加入PCR標準反應體系，同時檢測GSTM1和GSTT1基因，Albumin基因作為陽性對照，標準反應體系的引物濃度為10uM，反應體系總體積為20ul，由PCR試劑5ul，GSTM1基因、GSTT1基因和Albumin基因的正反向引物各0.4ul，20ng/μl的步驟2得到的DNA模板3μl和去離子水9.6ul組成；

GSTM1基因正向和反向引物：

正向引物：GAACTCCCTGAAAAGCTAAGC

反向引物：GTTGGGCTCAAATATACGGTGG

GSTT1基因正向和反向引物：

正向引物：TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC

反向引物：TCACCGGATCATGGCCAGCA

Albumin基因正向和反向引物：

正向引物：GCCCTCTGCTAACAAGTCCTAC

反向引物：GCCCTAAAAAGAAAATCCCCAATC

步驟3-2，PCR反應條件：

將反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為95℃預熱15分鐘；再進行35個循環的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分鐘后，降溫至4℃；

步驟3-3，將反應孔在PCR擴增儀反應后的產物進行電泳檢測：