技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基因藥物的載體的制備技術(shù)，尤其涉及一種糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法。

技術(shù)背景

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是人類基因庫的建立和人類疾病相關(guān)基因的闡明，疾病的基因治療應(yīng)運而生，并已發(fā)展為當(dāng)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個新的研究領(lǐng)域，被認(rèn)為是治療遺傳性先天疾病、惡性腫瘤、傳染病等最有希望的治療方案之一。

目前的轉(zhuǎn)染載體基本上可分為兩類：病毒載體與非病毒載體。非病毒基因載體能夠克服病毒基因載體的許多內(nèi)在問題，諸如無免疫原性、無遺傳毒性、細(xì)胞毒性低、成本低等等，是治療基因體內(nèi)給藥不可替代的傳遞系統(tǒng)，具有重要的臨床實用潛力。但是，相比于病毒載體，非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率低，限制了其實際應(yīng)用。

糖皮質(zhì)激素是一種強(qiáng)疏水性的類固醇激素，能與細(xì)胞中的糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合，形成激素-受體復(fù)合物，瞬間轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，通過正性或負(fù)性調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，改變細(xì)胞的生理功能。GR為多蛋白復(fù)合體，存在于幾乎所有脊椎動物組織細(xì)胞中，在無配體存在時主要存在于細(xì)胞質(zhì)，其核定位信號(NLS)被隱藏。GR與強(qiáng)疏水性的糖皮質(zhì)激素結(jié)合以后，NLS被暴露出來，其可以短暫改變核屏障的結(jié)構(gòu)與穿透性，將核膜上的核孔擴(kuò)張至60nm，有利于大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核。因此可以選擇糖皮質(zhì)激素作為NLS，提高基因載體的轉(zhuǎn)染效率。

聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)是一種陽離子聚合物，PEI的單體為-CH2-CH2-NH-，結(jié)構(gòu)骨架中每三個原子中含一個氨基，具有很高的正電荷密度，具有較強(qiáng)的DNA結(jié)合能力和細(xì)胞吸附能力。PEI具有強(qiáng)大的緩沖能力，被細(xì)胞內(nèi)吞后能抑制溶酶體內(nèi)酸化，防止所傳遞的DNA被降解，并改變?nèi)苊阁w中的離子滲透壓，引起溶酶體膜的破裂并釋放其中的DNA，即“質(zhì)子海綿”效應(yīng)。PEI的分子量范圍很寬，其分子量對其轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞毒性影響很大。分子量越高，PEI表面的電荷密度越大，轉(zhuǎn)染效率越高，毒性越大。低分子量PEI的毒性較低，其轉(zhuǎn)染效率也較低。PEI進(jìn)入細(xì)胞后不會進(jìn)入細(xì)胞核，因此如果將糖皮質(zhì)激素與小分子量PEI連接，預(yù)計能得到低毒、高效的基因載體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，本發(fā)明通過糖皮質(zhì)激素的NLS作用，可以提高基因轉(zhuǎn)染效率。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的基因載體材料的制備方法，包括以下步驟：

(1)將糖皮質(zhì)激素上的C-21羥基用甲磺酰氯酯化，合成糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯；

(2)將合成的糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯與低分子量PEI用Traut’s試劑連接合成目標(biāo)產(chǎn)物糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)具體為：取C-21羥基的糖皮質(zhì)激素用無水吡啶溶解，溶液于0℃，N₂保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過量的甲磺酰氯，反應(yīng)于0℃進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0℃的過量的純水終止反應(yīng)，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，即糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯。

進(jìn)一步地，所述無水吡啶的制備如下：吡啶中加入NaOH，加熱回流2小時，再蒸餾得到無水吡啶。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)具體為：將合成的糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯和Traut’s試劑溶于無水DMSO中，將低分子量PEI?1800溶于無水DMSO中，在N₂保護(hù)下滴加入前者溶液中，邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過量的冰的乙酸乙酯，過濾得到淡黃色沉淀，加入適量純水溶解，0.45μm微孔濾膜過濾，純水透析48小時。冷凍干燥得淡黃色固體，即為目標(biāo)產(chǎn)物糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺。

進(jìn)一步地，所述無水DMSO的制備如下：DMSO中加入氫化鈣，放置48小時，減壓蒸餾得無水DMSO。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明用糖皮質(zhì)激素修飾低分子量PEI，合成一種新型的基因載體材料，這種材料具有“質(zhì)子海綿作用”，能夠有效結(jié)合DNA，又能夠在糖皮質(zhì)激素的介導(dǎo)下加入細(xì)胞核，提高轉(zhuǎn)染效率，是一種低毒，高效，合成簡單的非病毒基因載體，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1是糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的合成路線；

圖2是糖皮質(zhì)激素21位甲磺酸酯的¹H-NMR圖譜；

圖3是糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的¹H-NMR圖譜；

圖4是糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的細(xì)胞毒性圖；

圖5是糖皮質(zhì)激素修飾聚乙烯亞胺的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率圖。