【技術(shù)領(lǐng)域】：

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)與惡性腫瘤的基因治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組腺病毒和真核表達(dá)質(zhì)粒，具體為以腫瘤細(xì)胞Akt1、PI3K?p85亞基和COX-2為藥靶的抗癌重組腺病毒和真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制人膠質(zhì)瘤、乳腺癌和胃癌的生長，對上述腫瘤具有放療增敏作用。

【背景技術(shù)】：

腫瘤本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，涉及癌基因的過表達(dá)和抑癌基因的突變、缺失等多環(huán)節(jié)、多通路的異常。傳統(tǒng)治療方法(包括手術(shù)，化療和放療)的效果都非常有限，生物靶向技術(shù)的興起為腫瘤的治療提供了新思路。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，一些小的雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)可以高效、特異地促使體內(nèi)特定基因mRNA降解，誘使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型，這種技術(shù)即RNA干擾(RNA?interference，RNAi)。在RNAi作用的起始階段中外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA被Dicer酶切割為19～21bp的小分子干擾RNA片段(small?interfering?RNAs，siRNAs)；隨后siRNA與核酶復(fù)合物結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA?induced?silencingcomplex，RISC)；RISC激活后通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上并切割mRNA，從而部分或完全抑制目的基因的表達(dá)。與常規(guī)的反義RNA和反義寡聚核苷酸技術(shù)比較而言，具有簡單高效地沉默特定基因的特性，在基因治療和基因調(diào)控中具有廣闊的應(yīng)用前景。而腺病毒載體具有宿主細(xì)胞范圍廣、高轉(zhuǎn)移效率、高滴度、高表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，是目前基因治療研究中應(yīng)用最為廣泛的載體。

制備表達(dá)siRNA的重組腺病毒，需要構(gòu)建可表達(dá)siRNA的腺病毒穿梭質(zhì)粒載體。目前，已經(jīng)有單獨(dú)商品化的表達(dá)siRNA的真核表達(dá)載體和腺病毒穿梭質(zhì)粒載體，但還沒有能將三種siRNA在同一載體中的聯(lián)合使用，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和整體動物水平的系統(tǒng)的RNAi實(shí)驗(yàn)研究。若能將表達(dá)多條有效的siRNA的DNA片段從siRNA的真核表達(dá)載體亞克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒載體上，進(jìn)而構(gòu)建表達(dá)多條siRNA的重組腺病毒，將會大大縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高研究效率及治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】：

本發(fā)明目的是公開一種應(yīng)用遺傳工程的方法在細(xì)胞內(nèi)獲得靶向敲低mRNA表達(dá)的構(gòu)建方案，即提供一種以腫瘤細(xì)胞Akt1、PI3K?p85亞基和COX-2為藥靶的抗癌重組腺病毒的構(gòu)建及用途。

應(yīng)用該方案獲取的重組腺病毒和真核表達(dá)質(zhì)粒可應(yīng)用于腫瘤治療，運(yùn)用該方法可以在實(shí)驗(yàn)條件下抑制人源性膠質(zhì)瘤、胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖；抑制瘤細(xì)胞侵襲運(yùn)動；同時影響其下游基因(如Mmps、Nfkb、p53、bax、caspases等)的表達(dá)；對腫瘤細(xì)胞具有增強(qiáng)效旁觀者效應(yīng)和放射治療增敏的作用。該腺病毒和真核表達(dá)質(zhì)粒在腫瘤治療藥物、放射治療增敏的制備中具有獨(dú)特的實(shí)用價值。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下

1)本發(fā)明提供了一組(三種)用于產(chǎn)生siRNA的DNA序列

DNA序列-1??AKT1?GGAGATCATGCAGCATCGC

SEQ?ID?NO.1

5’-GATCC?GGAGATCATGCAGCATCGC?TTCAAGACG?GCGATGCTGCATGATCTCC?TTTTTTGAATTCA-3’

SEQ?ID?NO.2

5’-AGCTTGAATTCAAAAAAGGAGATCATGCAGCATCGCCGTCTTGAAGCGATGCTGCATGATCTCCG-3’’

DNA序列-2?COX2?AACTGCTCAACACCGGAAT

SEQ?ID?NO.3

5’-GATCC?AACTGCTCAACACCGGAAT?TTCAAGACG?ATTCCGGTGTTGAGCAGTT?TTTTTTGAGCTCA-3’

SEQ?ID?NO.4

5’-AGCTTGAGCTCAAAAAAAACTGCTCAACACCGGAATCGTCTTGAAATTCCGGTGTTGAGCAGTTG-3’

DNA序列-3?p85?GAAAGGAGGAAATAACAAA

SEQ?ID?NO.15

5’-GATCC?GAAAGGAGGAAATAACAAA?TTCAAGACG?TTTGTTATTTCCTCCTTTC?TTTTTTGTCGACA-3’

SEQ?ID?NO.6

5’-AGCTTGTCGACAAAAAAGAAAGGAGGAAATAACAAACGTCTTGAATTTGTTATTTCCTCCTTTCG-3’