技術領域

本發明屬于分子遺傳學領域，尤其涉及線粒體DNA(mitochondrial?DNA， mtDNA)多態性基因型鑒定及點突變檢測方法。

背景技術

為了解mtDNA突變或多態性與疾病關聯而進行的病例對照研究中，往往 涉及對大量個體的多態性基因型進行區別鑒定；mtDNA相關疾病的分子診斷、 遺傳咨詢和用藥指導等服務，也都需要快速、簡便、有效的突變分析或基因 分型方法。

限制性酶類方法如限制性片段長度多態性(restriction?fragment?length polymorphisms，RFLPs)分析是當前進行mtDNA點突變或mtDNA單個位點 核苷酸多態性(mitochondrial?DNA?single?nucleotide?polymorphisms，mtSNPs) 檢測的主要方法，如mt4833A/G置換多態可通過Hae?II、mt5178C/A經Alu?I、 mt10398A/G經Bgl?I及mt15497G/A經Dde?I等不同限制性酶識別序列獲得 鑒定；但該方法僅適用于待檢多態性或突變位點附近存在適當的特定限制性 內切酶酶切識別序列的情況。

此外，由于mtDNA分子較小(16，569bp)，隨著DNA測序技術不斷進 步同時成本不斷下降，mtDNA全長或部分(如編碼區)序列分析也成為mtDNA 多態性和基因突變分析的常用方法，但這不僅需要特定的測序試劑盒和自動 測序儀及檢測設備等，還需要從長的測序結果中比對確定靶位點核苷酸，因 此對于mtDNA單個位點特定多態性的明確而言，這是一個消耗大量成本和工 作量而僅獲得非直接結果的不經濟的方法。

擴增難熔突變系統(amplification?refractory?mutation?system，ARMS)或 稱等位(基因)特異性擴增(allele-specific?amplification，ASA)是驗證性檢 測DNA序列變化的經典方法之一。ARMS-PCR基因分型檢測通常包括兩個 互補的PCR反應，使用相同的DNA模板和一條相同的共有引物及其他條件， 區別僅在于與共有引物配對的ARMS引物不同，一條3’末端與給定位點上 的一種特定核苷酸互補，與另一種則為錯配，反之另一條引物亦如此。因而 兩個反應只能選擇性擴增特定的DNA模板，即只有ARMS引物完全退火結 合的反應可順利進行，而3’末端不匹配引物的延伸受到阻滯。雖然在原理上 ARMS-PCR只要針對核苷酸可變(基因突變或多態性)位點進行特異性錯配引 物設計即可，但由于mtDNA分子大小及結構復雜度遠較核基因組DNA小， 且在細胞內呈多拷貝，導致其模板效用性遠較核DNA高，致使常規使用的僅 3’末端堿基(核苷酸)錯配的ARMS引物不足以形成對相同模板的擴增效率 差異，因此，現有技術領域中沒有將ARMS-PCR用于mtDNA突變或mtSNPs 檢測的方法。

發明內容

本發明的目的在于解決現有mtDNA基因型多態性分析方法的不足，針對 mtDNA模板效用性較核基因組DNA高而不易形成錯配引物間PCR擴增效率 差異的特點，提出一種優化改進的ARMS-PCR方法用于mtDNA點突變檢測 或mtSNPs多態性基因型鑒定。

本發明檢測mtDNA點突變或mtSNPs多態性基因型的ARMS-PCR方法 的詳細技術方案為：針對mtDNA突變或多態性待測位點，設計特異性ARMS 適配引物，使引物3’末端終止在待診位點，同時在ARMS引物(位于上游 或下游均可)3’端倒數3-4位增加設置兩個連續的堿基錯配，錯配方式為A-T 或G-C的互換；但ARMS-PCR擴增反應中增加模板mtDNA的用量為常規PCR 擴增mtDNA的2～10倍，如20～100ng總基因組DNA(其中包含mtDNA) /25uLPCR反應體系；PCR擴增獲得包含靶位點的一段mtDNA片段，最后通 過瓊脂糖凝膠電泳加以檢測，根據陽性反應確定待檢基因型。

對于mtDNA而言，其中存在大量密集排布的多態性位點，所選擇設計的 錯配ARMS引物中不應再包含其他潛在的不匹配核苷酸，因此本發明中，通 過選擇錯配引物的位置在上游或者在下游，可以盡量避開其他潛在的多態性 位點，從而避免可能的假陰性PCR擴增結果，這使得該方法的模板適用范圍 得以擴大。