技術領域

本發明屬于生物化工技術領域，特別涉及一種⁶⁰Coγ射線輻照微生物制備微生物油脂的方法。

背景技術

生物柴油是近年來基于環境惡化和能源危機發展起來的一種可替代化石燃料的可再生清潔能源。目前國內外對于生物柴油制備的研究主要集中于植物油或餐飲廢棄油脂方面，但利用植物油為原料成本高，其成本占到總生產成本的70％～85％，以餐飲廢棄油為原料，也存在原料難以收集和運輸的困難，這些都嚴重地制約了生物柴油的產業化進程，因此尋找一種廉價的原料成為了生物柴油產業化的關鍵。

微生物油脂(microbial?oil)又稱單細胞油脂(single?cell?oil)，是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內產生的大量油脂。生物柴油由各種動、植物油脂經酯化或轉酯化工藝而得，而大部分微生物油的脂肪酸組成和一般植物油相近，因此微生物油脂可替代植物油脂生產生物柴油(李小松，余揚帆.微生物油脂.食品科技，1997，(5)：8-9.Das?UN.Essential?fatty?acid?metabolism?in?patients?with?essentialhypertension，diabetes?mellitus?and?coronary?heart?disease.Prostaglandins，Leukotrienes?&?Essential?Fatty?Acids，1995，52(6)：387-391.)

在產油菌株中，酵母和霉菌被認為是良好的產脂微生物。隨著現代生物技術的發展，將可能獲得更多的微生物資源，如通過對野生菌進行誘變、原生質體技術和定向進化等手段都可能獲得具有更高產油能力的突變株，從而提高產油微生物的應用效率。1995年，羅玉萍等(羅玉萍，楊榮英，李思光，等.產棕櫚油酸酵母菌的分離和鑒定.微生物學報，1995，35(6)：400-403.)分離到一株高產棕櫚油酸的酵母，總脂中棕櫚油酸含量高達50.14％；1998年菌物系統報道，以拉曼被孢霉SM541為原始菌株，經過紫外線復合氯化鋰誘變處理，得到突變株SM541-9，其生物量由12.6g/L提高到28.8g/L，油脂含量由5.8g/L提高到15.7g/L，花生四烯酸含量由321mg/L增加到623mg/L(薛照輝，吳謀成.微生物油脂進展.山西食品工業，2002，(2)：10-11.)。清華大學吳慶余、繆曉玲通過異養轉化細胞工程技術獲得了脂類含量高達細胞干重55％的異養藻細胞(繆曉玲，藻類可再生能源的利用及藻細胞抗環境脅迫的研究[D]，北京：清華大學，2004.)。曲威等以斯達氏油脂酵母為出發菌株，經紫外線誘變選育出了一株高產油脂的優良酵母菌株，生物量可達24.2g/L；油脂量14.6g/L(曲威，劉波，呂建州，等.高產油脂斯達氏酵母菌株的選育及搖瓶發酵條件的初步研究.遼寧師范大學學報(自然科學版)，2006，29(1)：88-92.)。

⁶⁰Coγ射線作為物理誘變劑中電離射線的一種，可引發生物基因突變和染色體畸變，是一種得到高產目標菌株的有效手段。而用原生質體直接誘變育種，簡單可行，又可以提高正變株的變異幅度。目前，還沒有用⁶⁰Coγ射線輻照微生物生產微生物油脂的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種⁶⁰Coγ射線輻照微生物制備微生物油脂的方法。采用⁶⁰Coγ射線輻照產油微生物菌體或其原生質體，獲得油脂生產高產菌株，制備微生物油脂的方法。

其具體的工藝步驟如下：

1、將斜面培養的粘紅酵母，斯達凱依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等產油微生物用無菌水洗下菌體，顯微鏡計數調節細胞濃度為5-7×106個/mL，制備菌懸液。或將斜面培養的粘紅酵母，斯達凱依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等產油微生物接入液體培養基中，振蕩培養14-16h，3000-5000r/min離心，棄去上清液，用高滲緩沖液洗滌，將離心后的菌體用0.1-0.3％β-巰基乙醇和0.1-0.5％的EDTA預處理菌體；然后再用1-2％蝸牛酶和0.1-0.5％溶菌酶及0.1-0.5％纖維素水解酶混合酶液處理菌懸液10-20h制備原生質體，原生質體形成率大于90％時，離心去酶液，用高滲緩沖液洗滌，懸浮原生質體。