技術領域

本發明涉及一種小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒的構建方法。

背景技術

隨著全世界人口和壽命的增長，癌癥發病率和死亡率持續上升，癌癥繼續流行。PI3K/Akt途徑是人類腫瘤中最為活躍的細胞途徑之一，導致癌細胞的生存和增長，途徑中的許多成分是新藥研發的候選靶標。Akt1是該信號途徑的活性中心，在癌癥中是聯系上游突變調控蛋白和下游存活信號途徑蛋白的中間環節。2007年6月研究人員在人類乳腺癌、結腸直腸癌和卵巢癌中發現了Akt1中的一個復發突變(E17K)，該突變通過增強其膜聯系作用來激發這種激酶，這將Akt1與癌癥的發生直接關聯了起來。這一發現可以說是癌癥生物學中具有啟示意義的一個發現，證實Akt1是乳腺癌、結腸癌和卵巢癌的致癌基因。Akt1抑制藥物有可能很快走入臨床研究，將對包括肺癌、乳腺癌、直結腸癌和卵巢癌在內的腫瘤治療以及個性化治療產生重大影響，并有可能改變抗腫瘤藥物的研究方向。近年來，我們通過抑制PI3K信號通路治療腫瘤，臨床前的研究均表現出良好的結果。在國家863、國家自然科學基金等國家級科研項目基金的大力支持下，該通路的抑制劑已經非常接近成藥了。在相關的基礎研究方面，我們通過分子克隆技術構建小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒，而且對影響小鼠Akt1基因啟動子轉錄活性藥物也展開了深入的研究。因此，Akt1基因啟動子熒光素酶質粒有望成為探討抗腫瘤藥物篩選有效的研究手段，具有良好運用前景?？梢灶A見，今后很多發育生物學和腫瘤機制研究將圍繞小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒。同時，影響小鼠Akt1基因啟動子轉錄活性研究也將引起高度重視。通過構建小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒，方法簡單易行，在抗腫瘤藥物篩選中具有有廣泛的應用前景。

本發明首次利用分子克隆技術構建小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒，為研究Akt1在抗腫瘤藥物篩選找到了合適的研究途徑。此法也可用于腫瘤發病機制的研究和應用。

發明內容

本發明目的是通過分子克隆的方法構建小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒，以便用于抗腫瘤藥物篩選及腫瘤學的研究。

本發明所采用的技術方案是：

一種小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒的構建方法，它包括下列步驟：

(1)將包含小鼠Akt1基因啟動子片段插入pBluescriptIISKM(pBS)載體的XbaI位點間，構建包含小鼠Akt1基因啟動子片段的pBS/XbaI4.5質粒；

(2)將包含小鼠Akt1基因第一編碼外顯子ATG片段插入pBluescriptIISKM載體的NotI位點間，構建包含小鼠Akt1基因第一編碼外顯子片段的pBS/LA1.9質粒；

(3)將小鼠Akt1基因啟動子插入pGL3-basic載體的SamI和NcoI位點間，構建小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒pGL3/mAkt1-pro。

上述的構建方法，其特征在于通過探針檢測小鼠Akt1基因啟動子序列，其擴增核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

上述的構建方法，其特征在于所述構建包含小鼠Akt1基因啟動子片段的真核表達載體為pBluescriptIISKM，小鼠Akt1基因啟動子核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

上述的構建方法，其特征在于所述構建包含小鼠Akt1基因第一編碼外顯子ATG片段(1.9kb)的真核表達載體為pBluescriptIISKM，其擴增核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示。

上述的構建方法，其特征在于所述構建小鼠Akt1基因啟動子的真核表達載體為pGL3-basic，小鼠Akt1基因啟動子熒光素酶質粒核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

具體的操作如下：

(1)用含有小鼠Akt1基因的BAC(bMQ-94N15)用XbaI限制性內切酶消化，插入到用XbaI限制性內切酶消化并用堿性磷酸酶處理的pBluescriptIISKM質粒中，轉化后建立一個小型基因組文庫。然后用包含有Akt1基因Exon?0的片段一對引物作為探針，PCR后回收，對上述小型基因組文庫進行篩選，得到一個含有大小約4.5kb的片段，命名為pBS/XbaI4.5。將該4.5kb進行全序列測定，獲得該片段全長序列；