技術領域

本發明涉及微生物工程技術領域，特別涉及一種液體深層發酵生產角蛋白酶的方法。

背景技術

角蛋白酶能夠溫和高效地水解羽毛等角蛋白廢棄物，生產飼料、肥料。該法生產的飼料節約能源、成本低、質量好，能夠較好的被動物利用。在含角蛋白的飼料中，添加角蛋白酶也可以提高動物對角蛋白的吸收利用，提高經濟效益。角蛋白能夠選擇性的水解羊毛、皮革表面的角蛋白，有望取代傳統的羊毛剝鱗和鞣革工藝，實現傳統產業的綠色環保改造。角蛋白酶能改善化妝品、外用藥物在皮膚中的通透性，在醫藥、化妝品等工業也都有著廣泛的應用前景。開發廉價高效的角蛋白酶生產技術是保護環境和提高經濟效益的必然要求。

本次將粘金黃桿菌液體發酵技術應用到角蛋白酶的生產在國內尚屬首例，研究結果表明該方案是可行的。粘金黃桿菌為Chryseobacterium?L99，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.2295。

發明內容

本發明的目的是針對液體發酵過程中的營養需求與菌體生長的關系，提供一種液體深層發酵生產角蛋白酶的方法。

液體深層發酵生產角蛋白酶的方法包括如下步驟：

1)采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養基上，于18～37℃復壯培養18～36小時，得到復壯菌體；

2)將復壯菌體接種到液體種子培養基中，于18～37℃，100～300rpm條件下培養18～36小時，得到發酵種子；

3)將發酵種子按發酵培養基體積的5～15％接入發酵罐中，罐溫18～37℃、罐壓0.2～0.8kg/cm²，攪拌速率100～300rpm，通氣量為1∶0.3～2.0，發酵培養時間18～60小時。

所述的粘金黃桿菌為Chryseobacterium?L99，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.2295。

所述的斜面培養基的成份為：每1000毫升中含NaCl5～15克、酵母粉或酵母膏5～10克、蛋白胨5～15克、瓊脂粉10～20克和水900～1000毫升。

所述的種子培養基的成份為：每1000毫升中含NaCl5～15克、酵母粉或酵母膏5～10克、蛋白胨5～15克和水900～1000毫升。

所述的發酵培養基的成份為：每1000毫升中含可溶性淀粉0.1～100克、蔗糖0.1～100克、葡萄糖0.1～100克、酪蛋白0.1～100克、酵母粉或酵母膏0.1～100克、蛋白胨0.1～100克、角蛋白0.1～200克、K₂PO₄?0.1～10克、NaH₂PO₄·2H₂O1～10克、MgCl₂·6H₂O?0.1～5克和水900～1000毫升。

本發明與現有技術相比具有的有益效果：

1)本發明中種子培養基提供了菌體短期內快速生長所需的營養物質，培養20小時左右即可進行深層發酵。

2)本發明中液體深層通氣發酵培養基，營養成分配比合理，能夠保證粘金黃桿菌L99的生長和產酶需要。培養基材料豐富，整個分批發酵過程中只需一次配料、一次滅菌即可，具有省時、省工，又減少了由于中途加料造成污染雜菌的機會。

3)采用本發明中的液體深層通氣發酵工藝進行分批發酵，最終酶活可達100-400U/ml。酶活力單位定義：pH?8.0，50℃，200rpm每小時水解藍色角蛋白使595nm處吸光度增加0.001的酶量。

4)本發明是國內首次對粘金黃桿菌產角蛋白酶發酵工藝進行研究，對于該菌以后的實驗研究和工業化生產均有很大的指導意義。

5)本發明的發酵過程中利用了對環保不利的角蛋白為底物，成本低，在產角蛋白酶的同時又能解決環境問題，降解后的角蛋白用于飼料等行業可產生較高的經濟價值。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步詳細描述本發明。

實施例1

1)采用涂布或劃線的方法將粘金黃桿菌接種到斜面培養基上，于18℃復壯培養36小時，得到復壯菌體；斜面培養基的成份為：每1000毫升中含NaCl10克、酵母粉5克、蛋白胨5克、瓊脂粉15克和水980毫升。

2)將復壯菌體接種到液體種子培養基中，于18℃，200rpm條件下培養24小時，得到發酵種子；種子培養基的成份為：每1000毫升中的NaCl10克、酵母粉5克、蛋白胨5克和水980毫升。