技術領域

本發明涉及一種能夠一步實現雜交瘤細胞篩選及單克隆化的培養制備的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

自1975年科學家Kohler和Milstein創建單克隆抗體(McAb)技術以來，該技術不斷發展完善，其應用亦日益廣泛。融合細胞的克隆化，是獲得分泌單一抗體細胞株的必要步驟.目前。融合細胞克隆化的方法主要有下述幾種：

1.有限稀釋法??這是目前各實驗室通常采用的方法。即當細胞融合后，將融合細胞直接接種在含HAT選擇培養基的96或24孔板中，經ELISA檢測出的陽性孔，在盡快時間內將其細胞稀釋到4-8細胞/ml(相當于0.4-0.8細胞/每孔)。從統計學角度看，這一稀釋度可使約36％的孔每孔含1個細胞，當細胞數長到10～50％孔底時，用ELISA檢測，將檢測出的陽性孔按上述方法再克隆，直到90％以上單個細胞孔為抗體分泌陽性為止。有限稀釋法基于Poisson分布規律，因此準確地細胞計數是獲得合適的稀釋度的保證，這樣才能提高單細胞孔的比率。由于每孔中不止有一個融臺細胞生長，為防止陽性克隆被抗體分泌陰性細胞的過度生長所排擠，盡快克隆陽性細胞十分重要，但這難免會造成細胞死亡或染色體丟失。理想的結果是照上述稀釋度，有20～50％的孔中出現細胞生長。此外，液體培養基中成纖維細胞生長旺盛，也會妨礙雜交細胞株的生長。用此法一般至少需2～3次亞克隆，由于需要反復克隆再克隆，細胞培養的工作量大，操作繁瑣，克隆效率低。操作步驟繁瑣，工作量大，耗時長。

2.利用熒光激活的細胞分類器(FACS)：這種方法可以選擇健康活潑的陽性細胞進行克隆化培養。但由于檢測陽性細胞所需的抗原包被的熒光乳膠微珠的來源和質量所限，也由于昂貴的設備所限，該法未能普及。

3.軟瓊脂半固體培養基法：由于瓊脂熔點較高(45～50℃)，室溫下操作容易凝固，使其與細胞不易混勻，細胞分布不均，細胞生長受限，克隆挑選困難及不易檢測等。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術存在的不足而提供一種操作簡單，培養周期短，無需飼養細胞，易于一步實現細胞融合后雜交瘤細胞篩選及單克隆制備的方法。

本發明為解決上述提出的問題所采用的技術方案為：

(1)配制2倍DMEM基礎培養液：取Dulbecco改良型培養基干粉即DMEM干粉10～15克，加純水300～500毫升，加入3～5克碳酸氫鈉并充分攪拌溶解，用0.5～1.5摩爾每升鹽酸和0.5～1.5摩爾每升氫氧化鈉調節pH至7.0～7.4，過濾除菌，制得2倍DMEM基礎培養液；

(2)配制L-谷氨酰胺母液：稱取L-谷氨酰胺1～10克，加純水50-300毫升并加熱至完全溶解，除菌過濾，配制得濃度為200毫摩爾每升L-谷氨酰胺母液，按每管4毫升分裝，冷凍保存；

(3)配制β-巰基乙醇母液：取50～80微升β-巰基乙醇，加入到50-120毫升純水中，過濾除菌，配制得10毫摩爾每升母液，冷凍保存；

(4)配制甲基纖維素水溶液：稱取0.6～2.4克4000cp甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素，量取純水，分別在121～126℃滅菌30分鐘，無菌條件下量取17.5～70毫升已滅菌純水輕輕加入到甲基纖維素中，2～8℃低溫條件下攪拌20～24小時；

(5)HAT半固體培養基配制：在步驟(4)配制的甲基纖維素水溶液中加入步驟(1)配制的2倍DMEM基礎培養液15～60毫升，加入步驟(2)配制的L-谷氨酰胺母液0.25～1毫升，加入步驟(3)配制的β-巰基乙醇母液0.5～2毫升，再加入：胎牛血清10～40毫升，市售的100倍MEM非必需氨基酸0.5～2毫升，10000單位每毫升青霉素和10000微克每毫升鏈霉素混合水溶液0.5～2毫升，加入市售的50倍次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶溶液(即市售50倍HAT溶液)1～4毫升，2～8℃攪拌3～6小時，即得到HAT半固體培養基，也即雜交瘤細胞單克隆化半固體培養基；

(6)融合后的細胞放置35～38℃預培養16～24小時，然后用5～20毫升預熱至35～38℃的步驟(1)配制的2倍DMEM基礎培養液混勻，加入人類堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)200-800納克，再加入雜交瘤融合及克隆因子即HFCS?0.5～2毫升，混勻，再與步驟(5)配制的HAT半固體培養基輕輕混勻，35～38℃靜置10～30分鐘并排除氣泡，分裝到平皿并于37℃下5％的CO₂條件下培養；