技術領域

本發明涉及分子生物學、酶學、生物信息學以及基因工程等領域。具體涉及用pHsh表達系統制備重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶，以及應用重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶制備甘草次酸的方法。

背景技術

β-葡萄糖醛酸酶降解甘草酸產生甘草次酸或者單葡萄糖醛酸甘草次酸(Takashi?K.Microbial?production?of?glycyrrhetic?acid?3-0-mono-β-D-glucuronidefrom?glycyrrhizin?by?cryptococcus?magnus?MG-27.Biosci?Biotech?Biochem，1994，58：455-458)。國內外學者對于β-葡萄糖醛酸酶的研究注重于(1)甘草酸到甘草次酸或者單葡萄糖醛酸甘草次酸的轉化途徑的研究，以及甘草酸、甘草次酸的藥理及其生理功能；(2)對β-葡萄糖醛酸酶在腫瘤、癌癥中作用機理的研究，或在植物中作報告基因的研究，有些學者克隆該酶基因傳染真核生物，獲得高酶活的表達(馮世江，定向合成GAMG的菌株篩選及其催化特性的研究。石河子大學碩士學位論文，2006)。目前，以β-葡萄糖醛酸酶作為生物催化劑為目的的研究較少，研究報道僅見于魚紅閃，吳少杰，馮世江，李春研究組和Takashi?Kuramoto，Taiko?Akao等國內外學者。但是這些研究中所選用的基因都來自常溫生長的微生物，所產生的酶熱穩定性低，使用壽命短，不利于工業化應用。

海棲熱袍菌(Thermotoga?maritima)是一種生長在55～90℃的海底火山口附近、嚴格厭氧的細菌。海棲熱袍菌產生的β-葡萄糖醛酸酶(GenBank?NO.NC_000853)具有很好的熱穩定性(Rober?H，Thomas?L，Helmut?K，et?al.Thermotoga?maritima?sp.nov.represents?a?new?genus?of?unique?extremelythermophilic?eubacteria?growing?up?90℃.Arch?Microbiol，1986，144：324-333)，但是來源于嗜熱微生物的基因在大腸桿菌等常溫菌中進行表達時表達水平通常較低。Hamzah?M.Salleh等運用pET28a載體在大腸桿菌中對海棲熱袍菌β-葡萄糖醛酸酶基因進行表達，只能獲得大約5mg/L蛋白。因此，對于該酶的開發利用至關重要的研究是采用高效率的熱激載體進行基因表達，并對目標基因進行定點誘變，從而獲得高效低成本的制備方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用pHsh表達系統制備重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶的方法。

我們使用高效表達載體pHsh，對耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因進行高效表達，并通過基因定向改造改變mRNA的二級結構，實現了β-葡萄糖醛酸酶基因在大腸桿菌中的高效表達。從而獲得了產量高，成本低，易于純化的生產重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶的方法。熱激表達載體pHsh是由大腸桿菌sigma32因子識別和調控的質粒，通過熱激誘導，可以避免使用化學誘導劑。具有本底表達底，重組蛋白產量高的優點(Shao，Weilan，Huawei?Wu，Jianjun?Pei.A?novel?expression?vector?systemregulated?byσ³²?and?methods?for?using?it?to?produce?recombinant?protein，US?Patent?ApplicationNo.11/614,626(Represented?by?BAKER?Donelson))。

所說的重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶的制備方法，其特征在于，用表達載體pHsh表達耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因或其突變體，得到重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶；具體方法步驟如下：

(1)將耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因插入基因表達載體pHsh，構建成耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒pHsh-bg；

(2)對耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒pHsh-bg中的mRNA翻譯起始區潛在的二級結構進行在線分析，并通過基因誘變打破mRNA的莖環結構、降低自由能，得到優化的重組質粒；

(3)用耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒或優化的耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒轉化大腸桿菌獲得基因工程菌，并在基因工程菌的生長過程中進行熱激誘導，使耐熱β-葡萄糖醛酸酶得到表達；

(4)收集細胞，破壁并離心獲得粗酶液；

(5)對上述粗酶液中的重組酶進行純化得到純化的重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶。