[發明專利]一種制備重組耐熱β－葡萄糖醛酸酶的方法有效
| 申請號： | 200810018772.2 | 申請日： | 2008-01-23 |
| 公開（公告）號： | CN101250539A | 公開（公告）日： | 2008-08-27 |
| 發明（設計）人： | 邵蔚藍;裴建軍;王卓 | 申請（專利權）人： | 南京師范大學 |
| 主分類號： | C12N15/52 | 分類號： | C12N15/52;C12N15/70;C12N9/00;C12P7/42 |
| 代理公司： | 南京知識律師事務所 | 代理人： | 盧亞麗 |
| 地址： | 210097*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 制備 重組 耐熱 葡萄 糖醛酸 方法 | ||
1.?一種制備重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶的方法，其特征在于，用表達載體pHsh表達耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因或其突變體，得到重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶；具體方法步驟如下：
(1)將耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因插入基因表達載體pHsh，構建成耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒；
(2)對耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒中的mRNA翻譯起始區潛在的二級結構進行在線分析，并通過基因誘變打破mRNA的莖環結構、降低自由能，得到優化的重組質粒；
(3)用耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒或優化的耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒轉化大腸桿菌獲得基因工程菌，并在基因工程菌的生長過程中進行熱激誘導，使耐熱β-葡萄糖醛酸酶得到超量表達；
(4)收集細胞，破壁并離心獲得粗酶液；
(5)對上述粗酶液中的重組酶進行純化得到純化的重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶。
2.?如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，上述步驟(1)中所說的耐熱β-葡萄糖醛酸酶基因，是從海棲熱袍菌(Thermotoga?maritima)中提取基因組DNA，通過PCR擴增獲得。
3.?如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的基因誘變方法是：對海棲熱袍菌的β-葡萄糖醛酸酶的基因設計改變基因內部堿基的突變引物為，
引物1：5’-aggagatataaacatggtaagaccgcaacgaaa-3’，
引物2：5’-tcttgtcaacaattaacaggtcattggatcatgg-3’，
以耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒為模板進行定點誘變，得到優化的耐熱β-葡萄糖醛酸酶表達質粒。
4.?如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的大腸桿菌是大腸桿菌菌株K12或其衍生菌株。
5.?如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，大腸桿菌菌株K12的衍生菌株是JM109，BL21或DH5α。
6.?如權利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(5)中所述的純化方法是破碎細胞后，75℃處理1h，離心得到的重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶。
7.?權利要求1-6之一所述的方法，制備得到的重組耐熱β-葡萄糖醛酸酶作為催化劑，催化甘草酸轉化為甘草次酸的反應。
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