技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物脫毒組培快繁技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種洋水仙脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)與檢測方法。

背景技術(shù)

洋水仙(Narcisses)是從歐洲引入我國水仙新品種的統(tǒng)稱，為石蒜科水仙屬多年生草本植物。20世紀(jì)80年代后進(jìn)行較大規(guī)模的引入，主要用于春季花展，少量盆栽作為年宵花使用。洋水仙與中國水仙相比，具有花大色艷，清香宜人等特點(diǎn)；大部分品種副花冠成喇叭狀，且以黃色為多，因而又泛稱為“喇叭水仙”或“黃水仙”。洋水仙又是優(yōu)良的園林地被花卉作為切花使用。洋水仙一般通過分蘗的子球進(jìn)行繁殖，每個(gè)母鱗莖可分蘗2～4個(gè)小鱗莖。但是，由于病毒侵染導(dǎo)致逐年退化，鱗莖變小，開花能力下降。

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從英國引進(jìn)洋水仙新品種，擬通過脫毒組培技術(shù)大量繁殖脫毒鱗莖，以滿足國內(nèi)市場需要，同時(shí)克服病毒的危害和蔓延。我們從英國引進(jìn)栽培于溫室的洋水仙中發(fā)現(xiàn)，絕大部分植株均表現(xiàn)花葉和斑駁等癥狀。通過對病毒病原的普通生物學(xué)、血清學(xué)特征和基因組全序列的研究，首先鑒定、明確了侵染洋水仙的主要線狀病毒有4個(gè)屬的8個(gè)成員，包括馬鈴薯Y病毒屬(genus?Potyvirus)水仙黃條病毒(Narcissus?yellow?stripe?virus，NYSV)，水仙遲季黃化病毒(Narcissus?late?season?yellows?virus，NLSYV)，水仙退化病毒(Narcissus?degeneration?virus，NDV)，虎眼萬年青花葉病毒(Ornithogalum?mosaic?virus，OrMV)，香石竹潛隱病毒屬(genus?Carlavirus)水仙普通潛隱病毒(Narcissus?common?latent?virus，NCLV)，水仙無癥病毒(Narcissus?symptomless?virus，NSV)，柘橙病毒屬(genus?Macluravirus)水仙潛隱病毒(Narcissus?latent?virus，NLV)及馬鈴薯X病毒屬(genusPotexvirus)水仙花葉病毒(Narcissus?mosaic?virus，NMV)等8種病毒，這8種病毒單獨(dú)或復(fù)合侵染是引起洋水仙種質(zhì)嚴(yán)重退化的重要原因之一；同時(shí)提出以田間洋水仙發(fā)生的病毒，經(jīng)擴(kuò)增、克隆和原核表達(dá)制備成病毒特異性抗血清，進(jìn)而對洋水仙植株樣品進(jìn)行病毒ELISA檢測的方法(Chen?J?etal.2006.Archives?of?Virology，151：2261-2267；Zheng?HY?et?al.2006.Archives?ofVirology，151：1667-1672；Chen?J?et?al.2006.Archives?of?Virology，151：1673-1677；Chen?J?et?al.2007.Archives?of?Virology，152：441-448；Chen?J?et?al.2003，Journal?of?Phytopathology，151：26-29)。到目前為止有關(guān)洋水仙莖尖脫毒組培及病毒檢測的研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是，針對現(xiàn)有洋水仙常規(guī)生產(chǎn)繁種技術(shù)中所存在的繁殖率低，帶病毒率高，且通常呈多種線狀病毒復(fù)合侵染，而又難以分離純化等缺陷，提供一種能大量、快速繁殖鱗莖，又能脫除鱗莖所帶病毒并經(jīng)特異檢測，以確保無毒的洋水仙鱗莖脫毒、組培與檢測的配套方法。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。

一種洋水仙脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)方法，按如下步驟進(jìn)行：

(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為：

1)基本培養(yǎng)基：子鱗莖誘導(dǎo)、增殖及鱗莖生長培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)基用1/2MS培養(yǎng)基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

2)子鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+BA?0.1～1mg/L和NAA?0.05～0.5mg/L；

3)子鱗莖增殖培養(yǎng)基：MS+BA?0.05～0.5mg/L和NAA?0.1～1mg/L；

4)鱗莖生長培養(yǎng)基：MS+BA?0.01～0.1mg/L和NAA?0.05～0.5mg/L；

5)生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA?0.1～0.5mg/L；

(2)洋水仙脫毒組培鱗莖的培養(yǎng)：

1)鱗莖低溫處理：鱗莖經(jīng)8℃低溫處理2～4周；

2)鱗莖萌芽：將低溫處理后的鱗莖放在25℃培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)1～2周，使鱗莖快速萌芽；