技術領域

一種喹諾酮類抗生素多簇抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。

背景技術

喹諾酮是一類合成抗生素類藥物，英文名稱：quinolones(QNS)。在化學上與萘啶酮酸相關，其作用機理是直接作用于細菌的核、抑制細菌的DNA旋轉酶，使酶不能在DNA雙鏈上引入切口，破壞細菌的代謝和繁殖，迅速殺滅細菌。最初這類藥物用于治療尿道感染，現在已發展到治療系統感染疾病，并且在動物飼養中作為預防和治療藥物普遍使用。近年來，這些藥物在動物組織中的殘留已引起廣泛的注意，我國規定牛、雞、豬、羊、兔等動物的肌肉、脂肪、肝、腎食品中達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星(環丙沙星與恩諾沙星量之和)、沙拉沙星等喹諾酮類獸藥最高殘留限量0.01～1.9mg/kg，歐盟規定在動物肌肉、肝臟和腎臟中達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星(環丙沙星與恩諾沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等喹諾酮類獸藥最高殘留限量0.01～1.9mg/kg，日本在2002年7月1日對我國產蒲燒鰻魚實施磺胺類抗生素檢測后，又于2003年7月1日起對進口生鰻魚及其制品進行氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星殘留檢測，并且將限量控制在方法檢測限的0.05mg/kg。因此，氟喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的重視。為了建立快速檢測方法有必要合成一種喹諾酮抗生素多簇抗原，到目前為止，喹諾酮類抗生素多簇抗原合成方法還未見國內報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種喹諾酮類抗生素多簇抗原合成方法，所合成抗原所制備的抗體可對多種喹諾酮類抗生素產生識別，為今后人們的快速檢測的研究提供了方便的途徑。

本發明的技術方案：一種喹諾酮類抗生素多簇抗原的合成方法，以諾氟沙星為原料將其衍生化制備半抗原，進而再與牛血清蛋白采用戊二醛法偶聯合成抗原；

工藝步驟為：

(1)人工半抗原的合成

合成路線：

產物1的合成：

2-溴乙胺氫溴酸鹽和碳酸二叔丁酯Boc₂O反應，配比控制為碳酸二叔丁酯摩爾比過量20％，以甲醇為反應介質，三乙胺為催化劑，攪拌、加熱升溫到60℃，反應1h，然后室溫反應過夜；反應液真空濃縮，殘液溶于二氯甲烷，依次用0.5N的鹽酸、飽和食鹽水和飽和的NaHCO₃溶液洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，得淡黃色液體產物1，直接用于下一步反應；

產物2的合成：

產物1和諾氟沙星反應，配比控制為產物1摩爾比過量20％，以二甲基甲酰胺為反應介質，三乙胺為催化劑，攪拌、加熱升溫到80℃，反應過夜，冷至室溫，滴加0.5N的鹽酸控制pH至6，攪拌使體系重新冷卻到室溫，過濾，依次用蒸餾水、無水乙醇洗滌慮餅，干燥，得粗產品產物2，用乙醇重結晶；

產物3的合成：

產物2和三氟乙酸反應，脫碳酸二叔丁酯基：室溫攪拌反應3小時，真空濃縮，將殘留物溶于乙醇，加入三乙胺，靜止，過濾得到的粗品用乙醇和氯仿重結晶提純，得產品3半抗原，命名為N-2-乙胺-諾氟沙星；

(2)人工抗原的合成：合成路線：

透析袋的前處理：取5-10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用。

磷酸鹽緩沖溶液的配置：0.2Mol/L磷酸二氫鈉19mL，0.2Mol/L磷酸氫二鈉81mL加水至2000mL混合即為ph7.4的磷酸鹽緩沖液。

偶聯蛋白：

取0.1mmoL的產物3溶于2mL的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌下緩慢滴加戊二醛溶液，滴加至使戊二醛的最終質量濃度為1.25％，成A液；

取0.002mmol的牛血清蛋白溶于10mL的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中成B液；

攪拌條件下將A液緩慢滴加到B液中，攪拌過夜，PBS透析5天，得人工抗原N-2-乙胺-諾氟沙星-牛血清蛋白；

(3)抗原鑒定：2-乙胺-諾氟沙星-牛血清蛋白采用紫外掃描測定其偶聯比，分別在262nm、278nm處測吸光值，并計算其偶聯比。

本發明的有益效果：本發明合成了喹諾酮類抗生素的多簇人工抗原，合成步驟簡潔，有效，經過后處理，純度可達99％以上，完全可用于免疫分析中，為今后人們的研究提供了方便的途徑，可以滿足國內對其研究的需要。

附圖說明

圖1半抗原的液相色譜圖

圖2半抗原的質譜正離子圖

圖3半抗原的紫外吸收圖

圖4抗原的紫外吸收圖

具體實施方式

(1)人工半抗原的合成

合成過程：